SLC26A3与CFTR在肠道表面pH调控和碳酸氢盐分泌中的独特作用及其对囊性纤维化病理的纠正潜力

《Acta Physiologica》：Distinct Roles of SLC26A3 and CFTR in Surface pH Regulation and Bicarbonate Secretion in Human Intestinal Epithelium

本综述深入探讨了氯/碳酸氢盐交换体SLC26A3（DRA）与囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）在人类肠道上皮中的独特且互补的功能。研究利用可诱导SLC26A3过表达的人肠道类器官模型揭示，SLC26A3独立于CFTR主导表面pH稳态调节和碳酸氢盐（HCO3-）外排，并能纠正CF模型中的黏液素（MUC2）分布异常，但无法挽救CFTR依赖的流体分泌缺陷。这项工作阐明了二者在维持结肠黏膜健康中的非重叠作用机制，为理解相关疾病（如囊性纤维化和先天性氯腹泻）的病理生理及开发靶向治疗策略提供了重要见解。

动态表面pH调控与人直肠类器官单层模型

研究首先建立了一套实时监测肠道上皮细胞顶膜表面pH的方法。利用健康供体（HL）和囊性纤维化（CF，ΔF508纯合突变）患者的直肠类器官衍生单层，研究人员比较了在不同顶膜溶液（含碳酸氢盐的Krebs-Ringer缓冲液KRB、Tris-NaCl溶液、无缓冲NaCl溶液）下的表面pH动态变化。在稳态条件下，CF类器官的表面pH（7.23 ± 0.03）显著低于健康类器官（7.34 ± 0.03）。使用Tris-NaCl这种碳酸氢盐-free且初始pH为中性的溶液，可以有效排除低pH对碳酸氢盐分泌的刺激，从而直接测量上皮细胞的碳酸氢盐分泌能力。研究发现，细胞具有强大的能力，无论初始条件如何，都能在数小时后建立一个恒定的稳态表面pH。在达到稳态后，基底外侧加入福斯高林（forskolin）刺激，能在所有条件下引发类似的碳酸氢盐分泌反应，表现为表面pH立即上升并在约2小时后达到平台期。这表明肠道上皮细胞在体外生理条件下维持表面pH稳态的能力非常 robust。

DRA和CFTR在大肠表面pH调节中的独特作用

SLC26A3（DRA）和CFTR在结肠上皮沿隐窝-表面轴的表达模式不同。DRA在表面上皮表达最高，向隐窝基部逐渐降低，而CFTR在隐窝基部表达最高。为了阐明它们在人类大肠中的独特生理功能，研究使用了来自健康（HL）和囊性纤维化（CF）供体的直肠类器官。这些类器官被工程化为表达极低基础水平DRA的载体对照（veh），或在Tet-On启动子控制下过表达flag标记的DRA（DRA-OE），同时保持内源性CFTR表达。

表面pH调节动力学研究表明，在Tris-NaCl条件下，CF对照类器官与HL对应物相比，显示出显著降低的初始碳酸氢盐输出和表面碱化速率。值得注意的是，DRA-OE显著提高了HL和CF样本的初始表面碱化速率，使HL和CF类器官之间的反应均等化。达到稳态后，CF对照培养物的表面pH显著低于HL培养物。然而，CF_DRA-OE培养物也表现出增加的碱化速率，并达到与HL_DRA-OE培养物相当的表面pH水平。福斯高林刺激在所有培养物中诱导了表面碱化，但CF_veh样本的碱化速率和稳态表面pH显著减弱。使用KRB缓冲液作为顶膜溶液的平行实验产生了非常相似的结果，尽管由于溶液中预先存在的碳酸氢盐而无法监测初始碱化速率。重要的是，所有实验组的稳态和福斯高林刺激的表面pH值在Tris-NaCl和KRB条件之间惊人地一致。

研究还扩展到人类结肠类器官培养物。对照结肠类器官培养物维持的稳态表面pH（6.92 ± 0.05）明显低于直肠类器官，但与我们之前表征的Caco-2单层相当。使用10 μM CFTR_inh172抑制CFTR会导致对照结肠类器官表面显著酸化（ΔpH ~0.8）。尽管存在这种酸化，福斯高林刺激的碳酸氢盐分泌在CFTR抑制的结肠类器官中基本保持完整。DRA-OE即使在CFTR抑制下也能维持类似对照的稳态表面pH。值得注意的是，DRA-OE培养物在福斯高林刺激后表现出快速的表面碱化，无论CFTR状态如何，在刺激后的第一次测量中就达到了最大反应。尽管在未分化的结肠类器官中基础DRA表达极低，但DRA敲除（DRA-KO）培养物与载体对照结肠类器官相比，显示出适度但统计学上显著的稳态表面pH降低，证实即使这种低水平的内源性DRA也有助于基础碳酸氢盐分泌。此外，DRA-KO培养物对福斯高林刺激的反应与对照培养物相比显著减弱，表明DRA活性是结肠类器官中最大cAMP刺激的碳酸氢盐分泌所必需的。

结肠类器官和直肠类器官培养物之间不同的稳态pH谱和对CFTR功能障碍的不同反应表明，与CFTR和DRA相关的表面pH调节机制在这些模型中可能有所不同。尽管如此，两种模型都表明，在缺乏DRA功能的情况下，CFTR缺陷会严重损害上皮碳酸氢盐分泌能力，导致生理条件下稳态表面pH降低。增强的DRA功能可以有效地补偿由CFTR缺陷引起的碳酸氢盐输出减少，在稳态下促进表面碱化达到与健康对照相当的水平，并恢复对福斯高林的反应性。

DRA表达轻微增加健康而非CF直肠类器官的初始肿胀速率

CFTR的阴离子输出在调节肠道上皮流体分泌中起着既定作用。因此，研究调查了DRA与CFTR共表达是否影响CFTR介导的阴离子输出和上皮流体分泌。

CFTR缺陷在肠道类器官中的一个特征性形态学特征是管腔萎缩且形状偏心。在DRA-OE后，研究人员观察到与载体CF对照相比，CF类器官的圆度有所改善，这是由于管腔体积增加所致。定量分析证实，CF类器官的偏心值显著高于HL类器官。引人注目的是，DRA-OE降低了CF类器官的偏心度，但增加了HL类器官的偏心度，这些相反的效应最终减小了DRA-OE CF和DRA-OE HL类器官之间的偏心度差异，表明在稳态条件下通过DRA-OE使CF类器官形态正常化。

使用福斯高林诱导肿胀（FIS）试验研究激动剂刺激的流体分泌与CFTR和DRA功能的关系。在HL直肠类器官中，福斯高林刺激诱导进行性扩张，在60分钟内归一化面积增加至基线约180%。HL类器官中的DRA-OE使初始肿胀速率（ISR）提高了约50%，但60分钟后的累积肿胀与对照相比无显著差异。形成鲜明对比的是，CF直肠类器官在整个观察期间对福斯高林刺激没有反应。CF类器官中的DRA-OE不影响这种肿胀缺陷。

为了进一步研究结肠上皮中的这些动力学，研究人员对结肠类器官培养物进行了类似的实验，并增加了使用10或50 μM浓度的CFTR_inh172进行药理学CFTR抑制。对照结肠类器官表现出强劲的福斯高林诱导肿胀，在60分钟后实现约200%的归一化面积扩张。DRA-OE似乎增加了ISR和累积肿胀，但与载体对照相比，这些差异未达到统计学显著性。在10 μM CFTR_inh172时，载体对照和DRA-OE结肠类器官仅显示肿胀参数适度降低，在50 μM抑制剂浓度下，两种模型均显示ISR和总体肿胀显著下降。

这些发现表明，DRA共表达对福斯高林诱导的CFTR阴离子输出及其 consequent 流体分泌在结肠和直肠上皮中影响极小。CF直肠类器官表现出福斯高林诱导肿胀的完全消失，而10 μM CFTR_inh172对结肠类器官肿胀的影响可忽略不计，即使在50 μM升高浓度下也仅产生部分抑制。CFTR_inh对肠道流体分泌或离体黏膜（与单层培养物相比）短路电流反应的抑制效果减弱以前经常被观察到，可能是由于物质存在扩散屏障。类似的情况可能存在于嵌入细胞外基质的三维类器官中。

DRA不增加人类肠道上皮中CFTR介导的阴离子分泌

研究人员通过Using chamber电生理测量进一步评估了DRA和CFTR在阴离子转运中的功能相互作用。HL直肠类器官单层对顺序添加1.25和5 μM福斯高林表现出强劲反应。添加10 μM福斯高林和IBMX仅产生 modest 额外效应。DRA-OE单层表现出相似的反应，与载体对照相比，CFTR介导的电流没有显著增强。用CFTR_inh172抑制CFTR消除了所有条件下的福斯高林诱导电流，并消除了组间差异，证实观察到的分泌反应是CFTR依赖性的。随后添加UTP和布美他尼（bumetanide）产生最小效应，组间无显著差异，表明CFTR抑制后钙激活氯通道或其他NKCC1依赖的转运机制贡献可忽略不计。

CF直肠类器官表现出对所有测试福斯高林浓度的严重受损阴离子分泌反应，与其CFTR功能障碍一致。值得注意的是，CF类器官中的DRA-OE不能恢复或显著改善福斯高林诱导的电流，表明增强的DRA表达不能影响有缺陷的CFTR阴离子转运。

这些发现证明，DRA表达不增强人类肠道上皮中CFTR介导的阴离子分泌。这些发现与先前在异源表达系统中报道的DRA介导的强劲CFTR激活形成对比。这种差异的一个原因可能是，在内源性阴离子摄取途径低表达或缺如的情况下，通过异源表达的CFTR激活Cl^-外流可能诱导SLC26A3介导的Cl^-摄取。然而，在肠道上皮中，基底外侧阴离子摄取机制（NKCC1, AE2）维持细胞内氯可用性。已有研究表明，在鲨鱼直肠腺（其顶膜表达CFTR）中，Cl^-分泌的限速因素是基底外侧Cl^-摄取。同样，顶膜CFTR依赖的HCO₃^-分泌取决于基底外侧阴离子摄取转运体的表达和细胞内HCO₃^-的生成。优雅的实验和数学模拟表明，人类和豚鼠胰液中高HCO₃^-浓度是由于基底外侧Cl^-摄取机制表达低，这导致CFTR刺激后细胞内Cl^-浓度非常低，并增加了CFTR通道的HCO₃^-通透性。相比之下，小肠绒毛区域的CFTR高表达细胞以及小肠和结肠隐窝和绒毛基底的细胞表达NKCC1、NBCs和AE2，未分化的人源类器官也是如此。相比之下，小肠和结肠隐窝区域的未分化细胞以及小肠中的Best4阳性CFTR高表达细胞不表达DRA。最近对人类小肠类器官的研究表明，仅由分化绒毛细胞组成的类器官只有在表达不表达DRA的Best4阳性CFTR高表达细胞时才会向其管腔分泌液体。因此，CFTR和DRA在人类肠道中的共定位可能仅限于过渡放大细胞和成熟吸收性肠细胞之间的过渡区细胞。

DRA表达使CF直肠类器官中的黏蛋白分布正常化

黏液黏稠症（mucoviscidosis）和CFTR缺失小鼠中的CFTR功能障碍与杯状细胞增生、黏蛋白脱颗粒缺陷以及上皮表面存在黏稠黏液相关。研究人员采用免疫荧光共聚焦显微镜比较HL和CF直肠类器官模型作为载体对照或DRA-OE的黏蛋白分泌。

使用MUC2抗体和UEA1凝集素染色可视化类器官内的细胞内黏蛋白颗粒。由于类器官培养物未分化，杯状细胞相对稀少。这些产黏蛋白细胞顶膜侧强烈的鬼笔环肽（phalloidin）信号表明它们主要是非经典杯状细胞。

在健康直肠类器官中，MUC2免疫染色显示黏蛋白颗粒沿分泌途径在细胞核和顶膜之间广泛分布。相比之下，CF类器官显示出显著改变的黏蛋白分布模式，其特征是更大、更密集的MUC2阳性颗粒，在细胞的顶膜下区室丰度降低。

值得注意的是，DRA-OE显著改善了CF类器官中的黏蛋白分布，导致MUC2分布模式扩展，在顶膜下和顶膜细胞区室中的存在增强。UEA1染色产生了类似的结果。MUC2信号分布的定量分析证实，DRA-OE显著影响CF直肠类器官中的细胞内黏蛋白分布。

其背后的分子机制需要进一步研究，但可能涉及pH依赖的黏蛋白包装和分泌。杯状细胞分泌颗粒内的黏蛋白包装已被证明是pH和钙依赖的。此外，CF肠类器官培养物中杯状细胞的黏蛋白颗粒与野生型培养物相比保持异常碱性pH，而在我们的实验中，通过诱导CF直肠类器官中的DRA恢复碳酸氢盐外流，可能纠正了这种pH失衡。在小鼠结肠隐窝的隐窝口细胞中，slc26a3^-/-结肠细胞的细胞内pH显著比WT更碱性，证明了DRA作为结肠细胞碱排出器的重要功能。

总结

本研究证明了CFTR和更重要的是SLC26A3（DRA）阴离子交换体独立地碱化结肠表面pH。在具有高内源性功能性CFTR表达或非功能性F508突变蛋白的人结肠类器官中，诱导异源DRA表达导致同样高的表面碱化速率。相反，CFTR的阴离子和流体分泌活性不受DRA表达诱导的显著影响。此外，DRA表达无法挽救F508突变类器官中的流体分泌缺陷。然而，DRA表达使F508突变类器官中的高偏心度和异常黏液颗粒分布正常化，可能通过其作为结肠细胞主要碱排出器和pH调节剂的作用。总之，DRA挽救了CF突变结肠细胞中部分而非全部异常细胞生理学。DRA和CFTR的阴离子转运功能在天然结肠细胞中主要相互独立。