《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：Friedelin Ameliorates Nucleus Pulposus Inflammation by Increasing p65 Autophagic Degradation to Inhibit NF-κB Signalling Pathway
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本文发现天然三萜类化合物Friedelin (FD) 通过招募E3泛素连接酶RNF182，促进p65的自噬降解，从而抑制NF-κB信号通路，减轻髓核(NP)炎症和细胞外基质降解，为干预椎间盘退变(IVDD)提供了新的潜在治疗策略。研究结合体内外实验证实FD可有效缓解IVDD进程，机制涉及对p65磷酸化的选择性抑制及RNF182介导的蛋白降解。
引言
椎间盘退变(IVDD)是一种严重影响脊柱健康和生活质量的常见疾病，其特征是椎间盘的进行性退化，常导致慢性疼痛和功能障碍。髓核(NP)组织的慢性炎症被认为是驱动IVDD进展的关键因素。核因子κB (NF-κB)信号通路是炎症反应的核心调节者，但其在IVDD中的具体调控机制尚未完全阐明。Friedelin (FD)是一种从植物中提取的三萜类化合物，已有研究提示其具有抗炎特性，但其在IVDD中的作用及机制仍有待探索。
材料与方法
本研究使用颈椎不稳(CSI)小鼠模型模拟IVDD，并通过体外培养小鼠和大鼠原代NP细胞进行机制探讨。动物实验获得南方医科大学动物伦理委员会批准(SMUL2021014)。体内实验采用3 mg/kg剂量FD进行干预；体外实验使用1 μM和4 μM浓度FD处理细胞。通过组织化学染色、免疫组化、Western blot、qPCR、双荧光素酶报告基因检测、免疫共沉淀等技术评估FD对NP退化、炎症因子表达及NF-κB通路活性的影响。
结果
Friedelin减轻IVDD并改善NP退化
颈椎间盘组织学分析显示，FD治疗显著改善了CSI小鼠的NP退化程度，降低了组织学退化评分(HDS)和Pfirrmann分级。免疫组化结果显示，FD治疗组中胶原X (Col X)和基质金属蛋白酶13 (MMP13)的表达显著降低，表明FD有效缓解了IVDD的进展。
FD抑制NP细胞和体内的炎症反应
通过CCK-8实验确定FD对NP细胞无毒性作用后，研究发现FD能够剂量依赖性地抑制LPS诱导的炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS在mRNA和蛋白水平的表达。在CSI小鼠血清中，FD治疗同样显著降低了这些炎症因子的浓度，证实了其体内抗炎效果。
FD通过调节NF-κB活性缓解IVDD
机制研究表明，FD处理可浓度依赖性地抑制LPS诱导的p65磷酸化，而对IKK磷酸化无明显影响。在293T细胞中，FD能够抑制IL-1β和TNF-α诱导的NF-κB报告基因活性。通过过表达NF-κB通路关键分子发现，FD的作用靶点位于p65水平。
FD通过自噬降解p65抑制NF-κB信号
进一步实验表明，FD处理导致p65蛋白水平下降，但不影响其mRNA表达。环己酰亚胺(CHX)追踪实验显示FD加速了p65蛋白的降解。通过抑制剂实验发现，自噬抑制剂氯喹(CQ)能够逆转FD诱导的p65降解，而蛋白酶体抑制剂MG132无此效果，表明FD通过自噬途径促进p65降解。
FD通过招募E3连接酶RNF182促进p65降解
通过生物信息学预测和实验验证，发现E3泛素连接酶RNF182参与FD介导的p65降解过程。FD处理增强了RNF182与p65之间的相互作用，而敲低RNF182则消除了FD对p65的降解作用及其抗炎效果。
FD通过招募RNF182缓解IVDD
在动物模型中，FD治疗显著提高了NP组织中RNF182的表达。在NP细胞中敲低RNF182后，FD对p65磷酸化的抑制作用及其对炎症因子表达的调控作用均被逆转。同时，FD对Col X和MMP13表达的抑制作用也因RNF182敲低而消失，证实RNF182在FD缓解IVDD过程中起关键作用。
讨论
本研究首次揭示FD通过上调RNF182表达，促进p65与RNF182的结合，诱导p65发生K48连接的多泛素化，进而通过自噬途径降解，最终抑制NF-κB信号通路和炎症反应。这一机制不同于已知的E3连接酶在IVDD中的功能，为理解蛋白质稳态调控在椎间盘退变中的作用提供了新视角。FD的双重作用——抑制急性炎症反应和促进组织修复相关适应性过程，使其成为研究慢性退行性疾病机制的理想工具化合物。
结论
研究表明，FD通过招募E3泛素连接酶RNF182促进p65的自噬降解，有效抑制NF-κB信号通路活化，减少炎症因子产生，从而缓解IVDD进程。这一发现不仅阐明了FD抗炎作用的新机制，也为开发以RNF182为靶点的IVDD治疗策略提供了理论依据。
