《Translational Oncology》：Single-cell analysis identifies a stemness-associated tumor cell subpopulation and develops a prognostic scoring model in esophageal squamous cell carcinoma
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本研究针对食管鳞癌(ESCC)高度异质性及预后差的问题，通过单细胞RNA测序技术鉴定出具有干细胞特性的肿瘤亚群，并构建干细胞相关评分模型(SASM)。研究发现高SASM评分预示不良预后、免疫浸润减少及肿瘤突变负荷(TMB)升高，同时鉴定TFDP1为关键促癌基因。该研究为ESCC精准治疗提供了新靶点和预后评估工具。
食管癌作为全球常见的消化道恶性肿瘤，其预后极差，五年生存率长期低于20%。中国更是食管癌高发国家，其中食管鳞状细胞癌(ESCC)占比超过90%。尽管手术、放化疗、靶向治疗和免疫治疗等多学科治疗策略不断进步，但ESCC患者的总体治疗效果仍不理想。这种治疗困境主要归因于肿瘤的高度异质性、侵袭性生物学行为以及多数患者确诊时已属晚期。
肿瘤异质性是影响ESCC治疗反应和临床结局的关键因素。越来越多的证据表明，肿瘤由具有不同功能状态的细胞亚群组成，其中一些肿瘤细胞具有干细胞样特性（干细胞特性），如自我更新、高增殖能力和分化潜能。这些干细胞相关肿瘤细胞在肿瘤发生、进展、转移、治疗抵抗和复发中起着核心作用。然而，干细胞相关肿瘤细胞亚群在ESCC中的分子特征和临床意义尚不清楚，如何将单细胞水平的发现转化为临床可用的预后预测和免疫分层工具，也成为该领域亟待解决的科学问题。
在这项发表于《Translational Oncology》的研究中，研究人员利用单细胞RNA测序技术，系统分析了ESCC肿瘤组织的细胞异质性，识别出八个肿瘤亚群，其中一类细胞簇表现出显著的干细胞样和增殖特征，高表达MKI67、STMN1和UBE2C等基因。基于这一干细胞样亚群的标志基因，研究团队建立了一个干细胞相关评分模型(SASM)，并在独立的TCGA和GSE53624队列中验证了该模型的预后预测价值。
研究采用的关键技术方法包括：从TISCH数据库获取ESCC单细胞转录组数据(GSE160269)，使用Seurat软件进行质控、标准化和细胞聚类；通过inferCNV算法鉴定恶性上皮细胞；利用Monocle2进行伪时间轨迹分析；整合TCGA和GSE53624批量转录组数据，采用ComBat算法校正批次效应；通过LASSO-Cox回归构建预后模型；使用CIBERSORT、xCell和ESTIMATE算法评估免疫浸润和肿瘤微环境特征；通过体外功能实验验证关键基因TFDP1的生物学功能。
单细胞转录组分析揭示细胞组成和变化
通过单细胞RNA测序分析ESCC肿瘤组织和配对正常组织，研究人员系统解析了肿瘤微环境的细胞景观和异质性。基于经典标志基因的表达分布，准确识别了十三种主要细胞类型。比较肿瘤与正常组织中细胞类型比例发现，肿瘤微环境中多个细胞亚群的浸润有增加趋势，特别是调节性T细胞(Treg)和上皮细胞，尽管统计学上未达到显著差异。这些结果表明ESCC肿瘤表现出高度异质的细胞组成，特定亚群在肿瘤微环境中的富集趋势为深入研究其在ESCC发生发展中的作用提供了方向。
癌症干细胞亚群和功能异质性
通过inferCNV算法区分恶性上皮细胞，并进行无监督聚类和通路富集分析，研究发现cluster 1特征性高表达UBE2C、MKI67和STMN1等典型增殖相关基因。与已建立的标志物和相关文献比较表明，cluster 1也高表达癌症干细胞(CSC)特征基因，并富集于干细胞相关通路，表明cluster 1代表一个癌症干细胞亚群。 hallmark通路富集分析显示，cluster 1在细胞周期、G2M检查点和E2F靶标通路中具有最高的富集分数，同时表现出上皮-间质转化(EMT)和WNT通路的高活性，进一步支持其作为癌症干细胞群的身份。
伪时间轨迹中肿瘤细胞亚群的动态和增殖基因表达下降
通过Monocle2算法对恶性上皮细胞进行伪时间轨迹分析，揭示了清晰的分支结构。其中，具有干细胞样特性的cluster 1主要分布在伪时间轨迹的早期阶段。随着伪时间的推进，cluster 1细胞比例逐渐减少，表明从干细胞样状态向更分化的肿瘤细胞亚型转变。增殖相关基因分析表明，MKI67和STMN1的表达水平均沿伪时间轴逐渐下降，表明随着恶性上皮细胞从干细胞样状态向分化表型转变，其增殖活性相应降低。
干细胞相关评分模型(SASM)的构建和验证
整合GSE53624和TCGA队列后，基于干细胞富集肿瘤细胞亚群的标志基因构建并验证了SASM模型。主成分分析(PCA)显示批次校正后队列间样本明显重叠，证实了数据整合的有效性。单变量Cox回归分析确定了一系列预后风险和保护因子，LASSO回归进一步筛选出最具信息量的基因用于模型构建。多变量Cox回归证实了这些基因的独立预后价值。Kaplan-Meier生存分析表明，按SASM评分分层的高风险组患者总生存期显著较差。时间依赖性ROC曲线分析显示SASM模型具有稳健的预测性能。
高低SASM组间不同的免疫微环境和预后意义
细胞浸润分析显示，低SASM组浆细胞、树突状细胞和中性粒细胞浸润显著更高，表明抗肿瘤免疫反应更强。相比之下，高SASM组免疫细胞浸润水平普遍较低。肿瘤微环境特征方面，SASM评分与StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATEScore呈中度负相关，与TumorPurity呈正相关。突变分析显示高低SASM组间肿瘤突变负荷(TMB)无显著差异，但按SASM评分和TMB分层后，高SASM和高TMB亚组患者总生存最差。
SASM评分与肿瘤生物通路、癌症-免疫循环和药物敏感性谱的关联
SASM评分升高与多种致癌通路的激活显著相关，特别是上皮-间质转化(EMT)和血管生成等促瘤通路呈正相关，而与脂肪酸代谢和氧化磷酸化等抗肿瘤代谢通路呈负相关。癌症-免疫循环分析表明，SASM评分与免疫反应的大多数步骤负相关，特别是T细胞招募和肿瘤细胞毒性杀伤相关步骤。药物敏感性分析显示，高SASM评分患者可能对多种化疗和靶向药物更敏感。
TFDP1上调促进增殖和不良预后
相关性分析显示，TFDP1与SASM评分呈最强正相关。生存分析显示TFDP1高表达患者总生存较差。转录组数据和qPCR验证均表明TFDP1在肿瘤组织中显著上调。基因敲低实验表明，TFDP1沉默显著抑制ESCC细胞增殖和克隆形成能力。
该研究通过单细胞转录组学系统描绘了ESCC微环境和干细胞相关亚群的组成及功能特征，深化了对肿瘤异质性机制的理解。研究的创新之处在于构建了一个具有临床转化潜力的预后评估模型SASM，该模型不仅能够有效预测患者预后，还与肿瘤免疫微环境特征、致癌通路活化和药物敏感性密切相关。特别值得关注的是，研究鉴定出TFDP1作为关键分子，其高表达与不良预后相关且促进肿瘤细胞增殖，为ESCC的分子分层和靶向治疗提供了新方向。
这些发现对ESCC临床实践具有重要启示：SASM评分系统可作为预后评估的有力工具，帮助识别高风险患者；基于干细胞特性的免疫微环境特征分析为免疫治疗策略的选择提供了新思路；TFDP1作为潜在治疗靶点的发现，为开发新的靶向治疗方法奠定了基础。未来研究通过整合更大规模多中心队列、空间转录组学和多组学技术，有望进一步阐明ESCC异质性的进化动力学，加速个体化精准治疗的发展。
