《SCIENCE ADVANCES》：Mouse digit AAV gene delivery into fibroblasts regulates regenerative outcome
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本研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）对比分析小鼠再生性（P3）与非再生性（P2）指端截肢模型，鉴定出与纤维化和再生相关的成纤维细胞亚群及关键基因（如Pcolce2、Prelp、Ccl2、Mest），并开发了腺相关病毒（AAV）介导的局部基因递送技术，证明靶向调控成纤维细胞基因表达可改变骨骼再生形态与修复程度，为哺乳动物组织再生机制研究提供了新策略。
摘要
小鼠远端指端（P3）截肢后能自发再生，而近端指端（P2）则发生纤维化。本研究通过对比P2纤维化与P3再生过程中的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，计算鉴定出与纤维化和再生相关的成纤维细胞亚群及候选基因。为验证这些基因的功能，研究团队开发了一种高效的AAV介导的基因递送技术，靶向感染指端成纤维细胞。实验发现，在再生芽基中过表达促纤维化基因Pcolce2或Prelp会改变正常再生骨骼的三维形态，而在P2指端过表达促再生因子Ccl2或Mest则显著促进骨沉积。这些结果证实，计算生物学分析与AAV递送技术相结合，为揭示哺乳动物指端纤维化与再生的驱动因素提供了有力框架。
引言
小鼠指端是研究哺乳动物复合组织再生的理想模型。远端指骨（P3）截肢后能形成再生芽基并在28天内完全再生，而近端指骨（P2）截肢则导致纤维化愈合。既往研究提示P2与P3成纤维细胞存在先天差异，但缺乏对细胞亚群特异性基因功能的分析。本研究通过scRNA-seq时间序列数据直接比较P2纤维化与P3再生过程中的成纤维细胞异质性，并利用AAV技术进行基因功能验证，旨在筛选决定再生与纤维化结局的关键因子。
结果
P2纤维化与P3再生中的成纤维细胞亚群异质性
scRNA-seq分析显示，P2纤维化过程中成纤维细胞比例显著增加，且存在19个亚群，其中8个亚群在纤维化不同阶段呈现动态变化。通过整合P2与P3数据，发现即使处于稳态，两者成纤维细胞亚群比例也存在显著差异。空间转录组验证（如Pi16、Anxa8表达）进一步证实P2与P3成纤维细胞具有区域特异性分布。基因本体（GO）富集分析表明，P3富集亚群多与骨发育和免疫应答相关，而P2富集亚群则涉及GTP酶信号和细胞黏附。最终筛选出98个候选促纤维化基因和27个候选促再生基因。
AAV2/6介导的成纤维细胞基因递送
通过比较多种AAV伪型（6、7m8、8、9、PHP.S），发现AAV6在指端成纤维细胞中感染效率最高，且感染后3–10天表达达峰。免疫组化证实AAV6主要感染Vimentin+间充质细胞，且不影响正常再生或修复过程。
促纤维化基因过表达改变P3再生形态
在P3再生芽基中过表达Pcolce2导致再生骨骼沿近远轴（P-D）长度增加但前后轴（A-P）宽度变薄，而过表达Prelp则使骨骼变短增厚，提示二者通过调控细胞外基质（ECM）影响骨骼形态。Ccn3过表达未引起显著表型变化。
促再生基因诱导P2骨修复
在P2指端过表达Ccl2或Mest可显著增加新骨面积和长度，其中Mest诱导的骨再生效果尤为明显，伴随远端结缔组织聚集和SP7+成骨细胞增多。相反，Cxcl2过表达抑制骨修复，可能与中性粒细胞过度招募有关。
讨论
本研究首次通过scRNA-seq直接对比P2纤维化与P3再生的成纤维细胞动态，并建立AAV介导的基因功能筛选平台。发现Pcolce2、Prelp等ECM相关基因调控骨骼形态，而Ccl2、Mest等免疫调节基因促进再生，为理解组织修复结局提供了新视角。未来可结合多基因共表达或早期干预策略进一步优化再生效果。
材料与方法
实验使用野生型FVB/NJ小鼠，截肢后6天局部注射高滴度AAV（>1×1013vg/ml）。scRNA-seq数据通过Seurat软件分析，基因过表达通过qPCR验证，骨骼形态采用微CT（microCT）和荧光双标（钙黄绿素/阿尔新红）量化。统计方法包括ANOVA、MANOVA等，显著性阈值设为P<0.05。
