基于靶向弹性样多肽的LENN制剂优化mRNA递送：内吞机制新见解

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Optimizing mRNA delivery with targeted elastin-like polypeptide–based LENN formulations: Insights into the endocytosis mechanism

本文系统阐述了层状弹性样多肽核酸纳米颗粒（LENN）作为非病毒载体的优势，通过表皮生长因子受体（EGFR）靶向递送mRNA，并深入解析其以网格蛋白（clathrin）介导的内吞作用为主的内化途径。研究证实LENN具备高封装效率、冻干稳定性及体内外高效转染能力，脂质组学分析进一步揭示了磷脂动态重塑在内吞及内体逃逸中的关键作用，为开发可规模化生产、生物可再生的基因递送系统提供了新策略。

结构表征与物理性质

研究首先聚焦于LENN纳米颗粒的结构与物理性质表征。通过动态光散射（DLS）和冷冻电镜（Cryo-EM）分析发现，LENN的粒径强烈依赖于前体溶液浓度。在低浓度下（0.0025 mg/mL mRNA），LENN NP10（氮磷比N:P为10）的粒径可降至约100纳米，且表现出较低的多分散指数（PDI ≤ 0.3），表明颗粒均一性良好。封装效率测试显示，随着N:P比增加，mRNA的封装效率提升，尤其在经历肝素挑战后，LENN NP10及以上比例的制剂仍能保持近80%的封装效率，凸显其结构稳定性。Zeta电位测量表明，较高N:P比的LENN表面正电荷更高，这可能有助于其与带负电的细胞膜相互作用并保持胶体稳定性。冷冻电镜图像揭示了LENN NP10由2-3纳米的初级颗粒聚集形成约70-100纳米的簇状结构，而冻干处理后的颗粒尺寸未发生显著变化，证明了其良好的冻干复溶稳定性。相比之下，使用较短聚精氨酸片段（CD-PLR₅）制备的颗粒虽然初始粒径更小（30-50纳米），但稳定性远逊于CD-PLR₁₀基制剂，因此后续研究均采用CD-PLR₁₀。

LENN内吞机制的确定

为了阐明LENN的细胞内吞途径，研究团队利用Cy5.5标记的V24-EGF和MFP-488标记的mRNA，通过共聚焦显微镜和流式细胞术观察了EGFR高表达的T24膀胱癌细胞对靶向LENN的摄取情况。结果表明，V24-EGF LENN能被T24细胞高效内化，而游离表皮生长因子（EGF）的受体阻断则显著抑制此过程，证实了摄取依赖于EGFR的特异性结合。采用不同内吞途径抑制剂的研究揭示，网格蛋白介导的内吞作用抑制剂氯丙嗪（chlorpromazine, 5.0-50.0 μM）能剂量依赖性地显著降低mRNA和ELP的细胞内荧光信号，最高浓度下mRNA内化率降至5.0%。与之相对，小窝蛋白（caveolae）介导的内吞抑制剂菲律宾菌素（filipin）和巨胞饮作用（macropinocytosis）抑制剂细胞松弛素D（cytochalasin D）即使在最高测试浓度下也未引起明显的剂量依赖性摄取抑制。这些结果强有力地表明V24-EGF LENN主要通过网格蛋白介导的内吞途径进入细胞。有趣的是，尽管LENN表面呈现多价EGF，其内吞机制仍遵循单体EGF经典的网格蛋白途径，这与某些多价载体触发非经典途径的情况不同，提示内吞响应具有背景依赖性。此外，带正电的Polyion复合物通过非特异性吸附内吞进入细胞，其mRNA信号呈点状分布。

LENN的体外与体内性能评估

对LENN递送性能的评估显示，V24-EGF LENN（特别是NP10和NP15）在T24细胞中能实现高效的萤火虫荧光素酶（Fluc）mRNA表达，其荧光素酶活性显著高于未处理对照组，并与通过非特异性途径进入的Polyion复合物相当，证明了靶向LENN在特异性摄取后能成功实现内体逃逸和基因表达。一个关键发现是，含有10%甘油作为冻干保护剂的V24-EGF LENN NP10，在冻干并于-20°C储存3天后复溶，其mRNA表达效率与新鲜制备的溶液无显著差异，这为解决LNP（脂质纳米粒）等载体对超低温冷链的依赖提供了有前景的替代方案。在体内研究中，通过膀胱内灌注将标记的LENN递送至携带MB49原位膀胱癌的小鼠模型。结果显示，与未靶向的V40 LENN相比，V24-EGF LENN在肿瘤部位表现出显著更高的siRNA（MFP-488）和ELP（Cy5.5）荧光信号强度，且在30分钟至1小时的灌注时间内信号持续增强，突出了靶向递送在克服膀胱内给药挑战（如粘液层屏障和有限驻留时间）中的高效性。

LENN处理细胞的脂质组学分析：内吞机制的深入见解

为了更深入地理解LENN内吞过程中的细胞响应，研究对经V24-EGF LENN、V40 LENN和Polyion复合物处理的T24细胞进行了脂质组学分析。结果显示，在0至4小时的时间尺度上，所有处理均引发了细胞膜脂质的动态重塑。最显著的变化出现在磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰肌醇（PI）和鞘磷脂（SM）等脂质类别中。研究发现，不饱和PC脂质含量随时间增加，而饱和PC减少，这种变化有助于增强膜流动性，这对于内吞过程中的膜弯曲和囊泡形成至关重要。特别是溶血磷脂酰胆碱LPC (18:0)在V24-EGF LENN处理1小时后显著升高，其圆锥形分子结构有利于诱导膜外叶产生正性固有曲率，促进初始内陷。PI (38:5)的增加和PI (36:1/O-37:1/P-37:0)的减少，提示磷酸肌醇代谢参与调控，例如磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PI(4,5)P₂）已知在网格蛋白包被小窝形成中起关键作用。鞘磷脂（SM）水平的普遍升高可能与信号转导或脂筏形成有关，但其在网格蛋白介导的内吞中并非主要角色，可能反映了更广泛的细胞应激或通讯。尤为重要的是，仅在靶向V24-EGF LENN处理组中观察到磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰乙醇胺（PE）的显著变化。PS在0小时升高，1小时下降，4小时再次上升，暗示其可能参与早期内吞囊泡的成核与裂变（0小时），以及晚期内体过程（4小时）。PE（40:4和40:5）在0和1小时升高，4小时下降，PE因其可融合特性，被认为在促进LENN cargo的内体逃逸中发挥重要作用。这些脂质变化模式与共聚焦显微镜观察到的现象一致：0小时mRNA与ELP在内体中共定位，1小时信号开始扩散（提示逃逸），4小时部分残留共定位。脂质本体论（LION）富集分析进一步证实，V24-EGF LENN处理显著富集了与正性固有曲率、膜弯曲能力以及内质网相关脂质特征，而V40 LENN和Polyion复合物处理则分别显示出与膜流动性或表面水平膜重塑相关的脂质适应。这些数据共同表明，靶向LENN通过EGFR触发了特定的、动态的膜脂质重组，这些重组支持了高效的网格蛋白介导的内吞和后续的内体逃逸过程。

结论

综上所述，这项研究详细阐述了基于弹性样多肽（ELP）的LENN系统作为一种高效、靶向的非病毒基因递送平台的潜力。其优势在于可规模化生产、使用生物可再生材料、具备良好的冻干稳定性以及明确的内吞机制——主要通过网格蛋白介导的途径。深入的脂质组学分析揭示了细胞膜脂质动态重塑在LENN内吞和细胞内运输中的重要作用，特别是PS和PE在早期内吞和内体逃逸中的潜在功能。这些发现不仅深化了对纳米颗粒-细胞相互作用的理解，也为优化下一代基因治疗载体，特别是针对膀胱癌等疾病的靶向递送系统，提供了重要的理论依据和实践指导。