《Current Opinion in Genetics & Development》：Revitalizing psychopharmacology in the GWAS era: the potential of barcoded screening in drug discovery
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这篇综述系统阐述了在GWAS（全基因组关联研究）揭示精神疾病多基因本质的背景下，如何通过条形码技术（如MPRA）结合iPSC（诱导多能干细胞）衍生神经元/胶质细胞模型，实现从"单靶点"向"表型/通路聚焦"的药物发现范式转变，为开发针对精神分裂症等复杂脑疾病的多靶点药物提供新策略。
引言
随着组学技术的快速发展，精神疾病的复杂性逐渐被揭示。功能基因组学技术，如条形码大规模平行报告基因分析（MPRA）或多通路分析，能够直接检测致病变异和汇聚的生物学机制。同时，从个体诱导多能干细胞（iPSC）分化为各种脑细胞类型的技术突破，为在空前规模和上下文特异性下进行遗传和化学干扰筛选打开了大门。本综述聚焦于遗传和化学筛选方法的技术进展及其在人类复杂脑疾病细胞模型中的应用，以识别药物靶点和调节这些靶点的化合物。文中还介绍了在多重条形码分析方面的最新进展，旨在未来更好地理解已知和新药的多靶点药理作用模式。
条形码分析剖析精神疾病的遗传复杂性
积累的证据表明，神经元和胶质细胞都对脑部疾病有重要贡献。精神和神经退行性疾病的遗传结构显示，风险等位基因通常富集在基因调控区域（GREs），并汇聚于大脑的特定细胞类型。兴奋性和抑制性神经元与许多精神疾病（如精神分裂症、抑郁症和双相情感障碍）有强关联，而星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞则与神经退行性和神经炎症疾病相关。然而，神经元和胶质细胞构成一个功能整体，任一细胞类型的功能障碍都可能促成整个脑部疾病谱系。
功能基因组筛选评估单个小分子如何影响广泛且基本独立的细胞过程。这使得可以利用相同的读出技术（如MPRA）来评估外源或内源化合物以及单导RNA（sgRNA）。后者通常用于减少或沉默特定基因表达。这种读出技术的趋同在很大程度上消除了遗传筛选和化合物筛选之间的概念差距，为未来实现更高的流线化和成本效益铺平了道路。
在MPRA中，标准报告基因被数千个短独特分子条形码的文库所取代。MPRA被设计用于在体外和体内解析GRE相关等位基因的功能，允许在各种背景下研究信号级联的终点和转录因子（TF）活性功能。MPRA越来越被认为是研究个体风险等位基因和紊乱细胞信号的高通量技术。在一项解析精神分裂症相关风险变异的重要研究中，MPRA与表观遗传分析、CRISPRi、染色质环化分析和单细胞RNA测序（scRNAseq）通过称为大规模并行变异注释管道（MVAP）的方法进行了交叉验证。这项研究揭示，大多数单倍型连锁的遗传变异是非功能的，而少数功能变异以细胞类型特异性方式发挥作用。因此，设计有意义的MPRA以捕获疾病相关信息需要提取功能变异以生成报告子文库，从而实现信息丰富的遗传和化学干扰筛选。同时，在优化合成报告基因构建体设计以提高MPRA性能以监测多个TF活性方面也取得了进展。MPRA已被应用于监测细胞类型特异性效应（尽管目前仍在异源细胞系中），并解析选定工具化合物的作用。MPRA技术现在原则上允许在人类细胞模型中进行化学和遗传筛选，例如在从患者iPSC分化而来的神经元和胶质细胞中，以具有上下文特异性的方式询问疾病相关信息。我们预计，优化的MPRA试点研究将很快使化学和遗传干扰筛选的规模大幅扩大。考虑到上下文特异性的重要性，我们接下来总结与脑部疾病相关的表型筛选方法的最新进展。
人类细胞模型中的表型遗传和化合物筛选
神经元
人类细胞特异性模型的可及性是改进机制理解和发现人类药物及药物靶点的关键一步。第一个概念验证转录组药物筛选在简单的人类模型中使用神经祖细胞（NPCs），测试了来自多个精神分裂症患者和对照iPSC系以及人类癌细胞系的135种药物，证明了组间差异性的化合物治疗反应。然而，神经祖细胞可能对监测强效已知精神活性调节剂的效果不敏感，推测是由于缺乏受体表达和生理系统所具有的突触结构。这已在人胚胎干细胞（ESC）衍生的NPCs的蛋白质组学测试中得到证明，其中化合物效应仅在相同细胞类型的更成熟类器官模型中显现。
由于这些缺点，许多实验室已从使用未分化的NPCs转向产生更成熟神经细胞的方案。最近，使用基于大规模并行CRISPR的筛选，在具有诱导人星形胶质细胞支持的人iPSC衍生的兴奋性神经元培养物中，对1343个疾病相关基因列表进行了大型系统性筛选。这证明了在更成熟的神经元中使用所采用的功能基因组学平台进行高通量方法的可行性。
单独的兴奋性神经元活动不太可能包含复兴神经精神药理学体外药物发现所需的网络复杂性。添加抑制性细胞类型被认为对于重建更复杂的神经元网络至关重要，并已在3D模型中得到实验证明。
胶质细胞
胶质细胞功能障碍在精神疾病中的关键作用已被广泛报道，表明神经元并非唯一因素。由过度反应的小胶质细胞介导的神经炎症与重度抑郁症、精神分裂症和焦虑症相关，而与炎症反应和神经递质稳态相关的星形胶质细胞在抑郁症、双相情感障碍、精神分裂症和焦虑症中失调。同样，少突胶质细胞（OL）和髓鞘形成破坏在精神分裂症和双相情感障碍中也有报道。尽管如此，目前针对胶质细胞治疗中枢神经系统疾病的药物仍然有限，这凸显了针对胶质调节进行系统性化合物发现的必要性。
以白质缺陷为特征的疾病包括多发性硬化症、精神分裂症、注意缺陷多动障碍、阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）。先前优秀的综述总结了促进OL分化和（再）髓鞘化的化合物鉴定工作。多个成熟的平台现在支持此类发现：具有共聚焦成像的微柱阵列允许高通量筛选促髓鞘化化合物；小鼠干细胞衍生的少突胶质前体细胞（OPCs）的高内涵成像确定了咪康唑和氯倍他索作为在体外、离体和体内模型中有效的促髓鞘化剂。利用来自精神分裂症的异常iPSC衍生OL的类似策略是可行的，以增强转化价值。将OL转录组学与药物基因组学整合已产生有希望的候选物，包括亚叶酸和达克罗宁，它们在促进少突胶质细胞生成和小胶质细胞相关修复方面优于氯马斯汀。在人ESC衍生的OPCs/OLs中，CRISPR工程化的报告基因简化了高通量化合物发现，发现了新的命中化合物，包括Ro1138452和SR2211。
星形胶质细胞功能障碍同样涉及AD、PD、亨廷顿病和ALS，促进了在原代培养物和iPSC衍生的星形胶质细胞中进行化合物筛选，以识别星形胶质细胞调节药物或评估神经毒性。在iPSC衍生或人原代星形胶质细胞中的高通量筛选已识别出保护 against 氧化应激的化合物，以及调节星形胶质细胞反应性的化合物，如氟桂利嗪。在iPSC衍生的星形胶质细胞中，结合CRISPRi和scRNA-seq的CROP-seq允许系统性绘制调节星形胶质细胞炎症状态的可成药靶点图谱。类似的策略已应用于iPSC衍生的小胶质细胞，识别出针对小胶质细胞的新疗法。
总之，这些进展证明了在胶质细胞中进行功能基因组学 informed 的遗传和化合物干扰筛选的可行性。在精神疾病的人源化模型中进行筛选对于识别调节胶质功能的新疗法具有前景，而当前的精神科药物大多未靶向这些功能。
3D模型
为了进一步增加细胞模型的复杂性并捕捉神经和胶质细胞之间更生理的相互作用，包括不同类型的球体、类器官、生物打印组织和基质包埋培养物在内的3D共培养系统正在成为高通量化合物和遗传筛选的自然进展。出于资源效率考虑，这些模型系统通常可以保留用于验证目的，在使用更简单、成本效益更高的初级筛选识别潜在化合物命中之后。最近发表了一篇关于2D与3D细胞培养模型在精神疾病背景下的对比特性的全面综述。虽然已经在基质包埋的神经3D系统中进行了小规模的药物治疗，但我们未能找到将该技术升级应用于神经精神药物发现的已发表实例。
相反，对于人iPSC衍生的谷氨酸能神经元和星形胶质细胞的3D生物打印共培养物，已经专门设计了药物筛选应用。然而，更高的通量是通过成像模式实现的，这提供了下游效应的高度有价值的概览，但无法告知潜在的细胞机制，这一限制很可能阻碍了过去"表型"筛选的更广泛成功。功能基因组学使我们能够获得对潜在过程和潜在药物靶点的机制性见解，从而在为个体化治疗靶点量身定制的精准精神病学中发挥不可估量的作用。
在球体模型中，胶质细胞的重要性也得到了解决，并且已经成功进行了大规模遗传扰动筛选以阐明胶质-神经元网络的相互作用。这里建立了一个球状共培养系统，由iPSC衍生的兴奋性神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞组成，称为iAssembloids。此外，还为胶质母细胞瘤细胞浸润的神经球体建立了一个带有scRNAseq读出的治疗性药物发现平台，证明了使用化学诱导神经元在3D环境中筛选靶向肿瘤-神经元相互作用的候选化合物的可行性。公司Herophilus自我报告正在运行机器人、高通量脑类器官筛选，以识别位于单基因神经疾病Rett综合征基础的MECP2基因的激活剂。
药物靶点和通路活性的条形码分析
在前一章中，我们总结了表型药物筛选以及高度并行化的混合遗传干扰筛选所取得的巨大成功。后者有望在有意义的人类细胞模型系统中提供更多经过验证的药物靶点候选物。由于技术限制，基于靶点的药物发现迄今主要集中于单药物靶点。G蛋白偶联受体（GPCRs）和受体酪氨酸激酶（RTKs）经常被确定为关键靶点，因为它们在信号传导和疾病中的关键作用。最近，条形码读出技术实现了可扩展的多重化，允许同时监测多个靶点和条件。条形码功能分析可用于评估靶点和通路活性（这是性能优化的MPRA），可以单独或组合使用。受体活性尤其可以使用基因编码的分析系统进行测量，其中基于蛋白质-蛋白质相互作用的设计（例如，完整/分裂的烟草蚀纹病毒（TEV）、分裂泛素、合成Notch）直接释放合成的共转录激活剂以驱动RNA条形码报告基因。例如，GPCRs是最大且最易成药的受体家族，已使用条形码分析进行了广泛分析：一种分裂TEV方法能够并行分析19个GPCR，揭示了抗精神病药物如阿立哌唑和帕潘立酮的预期和新效应。此外，PRESTO-Salsa，一个基于完整TEV方法的全面条形码筛选平台，可以同时监测超过300个GPCR，并已识别出新的内源性、外源性和微生物GPCR激动剂。
或者，受体活性可以通过作用于合成增强子或启动子的内源性信号级联进行间接测量。例如，使用基于cAMP反应元件（CRE）的条形码通路分析在piggyBac生成的HEK293细胞系中，将39个嗅觉GPCRs与181种气味剂进行了映射，发现了79种新的受体-气味剂相互作用。瞬时转染与安全港（H11）整合的比较表明，稳定的CRE传感器提高了灵敏度，特别是对于非经典CREs。在使用H11整合报告基因对7800个ADRB2变体进行深度突变扫描中进一步证明了这一优势，强调了稳定整合对于条形码GPCR分析的价值。虽然条形码GPCR分析——特别是针对Gαs和Gαq偶联受体的分析——通常使用基于CRE的传感器来监测cAMP和钙信号，但这些分析可以扩展到其他通路，包括丝裂原活化蛋白激酶、免疫、增殖和应激信号，从而提供细胞反应的全面视图。最近在细胞系（包括HEK293）中多重TF活性分析方面的进展扩大了可用于条形码通路分析的报告基因库。此外，条形码分析被用于分析ERBB家族RTKs，从而识别出新的ERBB4调节剂。通过整合针对多个药物靶点类别的功能性条形码分析，将17种化合物针对选定的疾病相关GPCRs、RTKs、核受体和一种蛋白酶进行了筛选，同时监测cAMP、钙和MAPK通路活性，从而识别出新的化合物特性。从概念上讲，这种跨越多靶点类别的条形码方法可以取代药物发现早期阶段为解决关键脱靶效应而需要的繁琐的个体体外分析工作。
结论
通过全基因组关联研究（GWAS）已发现大量与脑部疾病相关的风险变异，而多重条形码分析现在能够系统、经济地解析这种遗传复杂性，提供高分辨率的分子见解，以补充从经典表型筛选获得的细胞读数。此外，通过在多药物靶点类别（包括但不限于GPCRs和RTKs）的同时分析方面取得的进展，可以通过条形码高通量功能分析更好地理解多靶点小分子的混杂作用模式。重要的是，在人iPSC衍生的神经元、胶质细胞和3D共培养系统方面的进展现在能够捕获有意义的细胞类型特异性反应和网络水平机制。然而，尽管有这些有希望的进展，人体内神经元网络的成熟非常缓慢，自发组装的类器官仍然主要重现神经发育方面，可能无法准确模拟成熟成年脑回路中的药物作用。
为了获得更具临床相关性的结果，该领域将不得不继续增加三维球状样模型的复杂性，这些模型更准确地反映成熟的生理网络，由不同的细胞类型组成，包括几种具有兴奋和抑制特性的更成熟的TF诱导神经元，并由胶质细胞支持。通过读出技术的趋同，当前可用的技术已经允许进行大规模的统一的遗传和化学扰动筛选，这些筛选与足够复杂的细胞模型结合，将为针对疾病相关细胞机制的精准治疗铺平道路。
