《Advanced Healthcare Materials》：Start, Stop, Rewind, Repeat—Cyclic Exposure of Adipose Stromal Cells-derived Cartilage Organoids to Chondrogenic and Proliferative Cues to Achieve Scaled-up and Customizable Bone Formation by Endochondral Ossification
2.1 新型循环体外方法补充ASCs源性软骨类器官中的软骨形成祖细胞
在组织工程领域，祖细胞作为来源与资源在体外生成新组织过程中会逐渐耗竭。本研究采用已建立的ASCs源性软骨类器官生成方案，通过动态细胞培养系统对抗祖细胞耗竭现象。软骨形成启动（Start）4周形成软骨组织后，撤除软骨形成培养基中断分化过程（Stop），随后暴露于增殖培养基（含10% FBS和5 ng/mL FGF-2的无血清培养基），在类器官外围重建未分化细胞层（Rewind）。最终再次暴露于软骨形成因子，在周边沉积新的软骨基质（Repeat）。
流式细胞术分析显示，起始ASCs p1群体均一表达基质间充质表面标志物CD90和CD44。软骨类器官形成过程中，间充质干细胞逐渐转化为软骨细胞，丢失CD90和CD44表达，分泌糖胺聚糖（GAG），形成富含Sox9+和II型胶原（Col2）阳性细胞的致密软骨细胞外基质。增殖信号刺激8周后，间充质干细胞比例从26±4%显著增加至52±20%，其中双阳性（CD90+CD44+）群体从18±1%增至60±24%。特别值得注意的是，CD73（与间充质干细胞软骨形成和成骨潜能增强相关的表面标志物）在CD90+CD44+-MSCs群体中有28±7%呈阳性，与起始ASCs p1群体（CD90+CD44+CD73-占92±4%）截然不同。
CP类器官呈现明显的周围层——称为软骨膜层——GAG染色阴性和Col2阴性，但含有高细胞密度和增殖性软骨形成祖细胞（Sox9+Ki67+细胞）。即使经过4周增殖信号暴露，CP类器官仍保持高GAG含量和内部Col2表达，表明软骨类器官的外层最易受增殖信号影响。重新暴露于软骨形成因子后，软骨膜层能够产生新软骨，表现为流式检测间充质干细胞标志物表达逐渐丢失、GAG释放增加以及番红O染色和全片染色GAG和Col2阳性信号。
2.2 新形成软骨膜层增强模块化自下而上方法中的软骨类器官融合并实现可扩展定制化软骨移植物体外生产
近年来，软骨类器官作为构建块在模块化自下而上方法中生成更大移植物方面得到探索。本研究利用ASCs源性软骨类器官形成软骨膜层的能力，采用受剑山生物打印启发的方法增强软骨类器官融合。将4周软骨形成培养基处理的软骨类器官（2个单位）组装在27G针上，暴露或不暴露于1周增殖培养基，随后进行3周软骨形成培养基处理。
增殖阶段形成厚厚的软骨形成祖细胞结缔层，嵌入Col1基质中且GAG阴性。重新暴露于软骨形成因子后，结缔ECM在3周内逐渐从Col1转变为Col2，形成均质软骨组织。相比之下，无增殖阶段时，软骨融合由少量软骨细胞迁移和两个软骨类器官间直接沉积Col2 ECM介导，导致组织整合不良。层粘连蛋白和纤连蛋白——两种支持细胞粘附、迁移、基质重塑和软骨分化的主要ECM蛋白——在融合软骨类器官表面高表达。
使用几何密实度（物体面积与其凸包面积之比）量化软骨融合效率。两个完美球体无融合时密实度为0.880，完美融合为1。增殖阶段将软骨类器官融合密实度从0.934±0.007提升至0.970±0.002，而无增殖阶段仅从0.895±0.014增至0.936±0.002。
进一步利用这种增强的软骨类器官融合方法在体外生成更大更复杂的移植物。软骨形成早期诱导增殖阶段也会富集类器官外层，同时保留体外生成软骨的能力，尽管软骨基质产生延迟1周。通过调节组装软骨类器官的数量和大小，成功控制构建体的长度和形状，生成由厚软骨外壳和未分化核心组成的纵向移植物。迭代增殖和软骨形成诱导过程，将10个纵向软骨移植物（来自40个未成熟软骨类器官）组合形成3D环状宏观组织，证明该方法生成复杂尺寸和形状可扩展软骨组织的可调性。
2.3 指骨形状软骨组织在体内通过ECO有效重塑为骨器官并保持形状
为治疗并指畸形（导致手指短缩或缺失的罕见先天性肢体异常）儿童，按照图3B方法生成由4个单位组成、模仿小指骨形状和大小的纵向软骨移植物，称为指骨形状脂肪源性组织工程软骨（Pa-TEC）。采用异位免疫缺陷小鼠模型评估Pa-TEC骨形成能力，模拟空指骨袋临床场景和自体设想组织工程策略。
植入前1周，软骨形成培养基更换为DMEM，使软骨趋向肥大化。此时Pa-TEC包含表达X型胶原（Col10）和基质金属蛋白酶13（MMP13）的大型肥大软骨壳、未分化祖细胞软核心和软骨膜周围层。体内ECO重塑过程对所有测试供体均稳健且可重复，形成类似于长骨发育过程中软骨生骨和软骨内骨髓形成的骨器官。
测试5个成人供体（30-56岁，1男性，4女性）和3个儿科供体（12-25个月，全部男性）评估Pa-TEC骨重塑稳健性。每个供体生成12-16个Pa-TEC，体外保留或体内植入后4周、12周和24周取出。微型计算机断层扫描（μCT）数据显示矿化组织量、骨体积/总体积比（BV/TV）和小梁厚度（Tb.Th）测量值。
为更好表征ECO重塑和准确量化骨形成，生成顶部、中间和核心层三个不同深度（间距250-500μm）的组织切片进行组织学分析。植入初期，植入组织从软骨膜层开始矿化，同时在植入Pa-TEC核心软骨处形成未成熟小梁骨。4-12周期间，大部分骨网络形成，矿化从5.83±4.23%增至14.45±6.20%，12周时BV/TV高达64.10±15.81%，HE切片检测骨量从4周0.47±0.74%增至12周12.44±4.79%。骨网络形成同时，软骨组织逐渐被骨髓腔替代，软骨含量从66.13±19.56%降至39.06±11.57%再至16.71±20.49%，骨髓组织从0.07±0.26%出现至16.13±11.51%再至53.14±25.74%。24周后，植入Pa-TEC重塑为具有皮质骨壳、大骨髓腔和致密成熟内小梁网络的骨器官，软骨组织残留极少。
儿科供体尽管软骨形成潜能较低（组织软骨形成37.92±9.45%，成人62.48±9.15%），但Pa-TEC也能通过相同ECO过程重塑为骨器官。儿科Pa-TEC重塑速度较慢，24周植入后核心层软骨持续存在较高（30.81±22.25%），骨髓含量减少（20.86±11.58%），但骨形成稳健（18.45±10.95%）。
2.4 植入细胞和宿主募集细胞对骨形成和重塑的贡献
骨组织工程关键因素是确保工程化移植物与宿主自身组织整合并最终被替代。本研究通过检测人核（huNu）、人I型胶原（hCol1）和X型胶原（Col10），研究植入人细胞和宿主募集小鼠细胞在ECO过程中对骨形成和重塑的贡献。
数据显示，人植入细胞负责启动植入Pa-TEC外围和核心的骨形成（通过hCol1沉积显示）。随后，宿主募集细胞从外围（4-12周间）开始侵入植入构建体并重塑人骨基质，后期在核心（12-24周间）进行重塑。huNu和hCol1定量分析证实这种人向鼠骨重塑过程，小鼠细胞和小鼠源性骨比例在整个植入期间增加，证明Pa-TEC成功整合并最终被宿主骨组织替代。
2.5 评估植入Pa-TEC可预测性和生物力学性能以利未来临床应用
鉴于设想临床应用性质（并指畸形儿童指骨构建），研究（i）GAG释放（μg/Pa-TEC/周）作为潜在疗效释放标准；（ii）Pa-TEC是否具备机械适应性支持手指运动。
有趣的是，每个个体Pa-TEC的ECO能力可通过植入前DMEM阶段1周积累的GAG量进行体外预测，与12周和24周μCT检测矿化含量（r=0.8732，p<0.0001）和取出Pa-TEC长度（r=0.8749，p<0.0001）强相关。GAG释放低于100μg/Pa-TEC的低分化Pa-TEC易被吸收，而GAG释放高于150μg/Pa-TEC的Pa-TEC呈现稳健骨形成（矿化体积>10mm3）并保持形状和大小（长度>5mm）。这种非破坏性检测方法易作为潜在释放标准实施，保证Pa-TEC骨重塑成功。
通过定制三点弯曲测试评估体外和体内成人Pa-TEC生物力学性能。Pa-TEC生物力学特性反映其组织组成。体外Pa-TEC弹性极佳，在加载针压力下易弯曲不断裂，最大应力0.56N。植入4周和12周后，尽管矿化含量高，但观察到类似曲线（即移植物平滑变形无断裂），由于软骨组织持续存在，记录最大应力更高（4周6.42N，12周22.1N）。相比之下，体内24周后Pa-TEC（现为软骨已重塑为骨髓腔的成熟骨器官）在生物力学测试中易断裂，位移曲线连续下降，记录最大应力6.20N。
基于记录应变弹性区域斜率计算每个测试Pa-TEC弹性模量，量化ECO过程中刚度增加。Pa-TEC刚度在ECO过程中稳定增加，从植入前0.26±0.10MPa增至体内24周后87.75±88.59MPa。虽然刚度显著增加，但仍低于测试小鼠胫骨获得的472.11±150.74MPa。这种差异可部分归因于体内异位模型移植物ECO重塑期间和之后缺乏机械刺激。此外，弹性模量与μCT检测矿化含量相关（r=0.7449，p<0.0001）。
3 结论
本研究报道基于脂肪源性软骨类器官自组装的可扩展、可调谐骨组织工程策略，用于治疗先天性和大骨缺损。证明软骨形成祖细胞如何在软骨形成分化后补充并随后再分化的"启停回放"方法；利用这种细胞可塑性生成作为生物水泥的软骨膜层，有效将多个软骨类组装成更大更复杂移植物；通过简单迭代增殖和软骨形成阶段，每个所得升级软骨移植物本身可作为生物构建块进一步增加尺寸和/或复杂性，强调提出方法的重复功能。
该组织工程策略具有潜在临床转化和首次人体应用多个优势：ASCs是易获得细胞来源，适用于成人和儿科环境；体外制造简单直接，尺寸和形状可定制（可能满足患者特定需求），稳健且易适应GMP环境；作为构建块的ASCs源性软骨类器官尺寸适中（5-15mm3），与微聚集体策略相比需要少量祖细胞；组装/融合步骤由新ECM沉积介导，不需要水凝胶等额外填充材料，产生机械适应性均质软骨组织；体内这些移植物（称为Pa-TEC）重演发育性ECO，软骨生骨和软骨内骨髓形成通过植入细胞和宿主募集细胞协同合作，随时间生成组织结构和机械强度类似于天然骨的完全整合骨器官；最后证明可溶性GAG含量可作为可靠生物标志物预测此类移植物植入后骨形成能力。
4 研究局限性
本研究使用的异位无负载体内模型准确模拟空指骨袋设想临床场景，周围骨骼和机械负载大多缺失。为拓宽该组织工程策略转化潜力，需要临床相关原位和机械负载环境下进一步体内研究，评估宿主-构建体界面整合、骨和附着点形成以及关节表面负载适应。相对较小的Pa-TEC尺寸（虽然适用于治疗并指畸形儿童）不需要预血管化以实现稳健ECO。更大组织工程软骨移植物中，高效骨重塑是否需要预血管化有待证明。另一个局限性涉及ASCs源性软骨类器官响应增殖信号出现的间充质干细胞群体起源未完全阐明。为明确此类群体起源和异质性，需要进行谱系追踪和单细胞测序实验。
5 实验部分
5.1 细胞分离与细胞培养
脂肪组织和吸脂物在巴塞尔大学医院总医院同意下获得，遵循患者知情同意，符合瑞士西北中部伦理委员会（EKNZ）遵循瑞士人类研究法（HRA，RS 810.30）第2条第2款c项。使用成人供体（7供体，1男性，6女性，年龄30-74岁）和儿科供体（3供体，全部男性，年龄13.5-29个月）。所有测试供体，从脂肪组织或吸脂物分离的SVF细胞按照先前方案回收。
5.2 胶原支架制备
圆柱形胶原海绵支架从商业可用Becton Dickinson的Avitene Ultrafoam胶原海绵获得。从胶原Ultrafoam片（8cmx12.5cm h 3mm）制作直径4mm、6mm或8mm活检打孔，保持干燥无菌4°C直至细胞培养使用。
5.3 软骨类器官形成
除非另有说明，软骨类器官生成如下：ASCs p1（0.5×106细胞）接种于圆柱形直径4mm x h 3mm胶原海绵支架，置于涂有2%琼脂糖的12孔板，暴露于软骨形成培养基。
5.4 软骨类器官融合与Pa-TEC生成
未成熟或成熟软骨类器官（最少2个最多7个单位）穿刺中心组装在27G针上。组装后，软骨类器官暴露于无血清增殖培养基1周，然后重新暴露于软骨形成培养基2周（除非另有说明）。根据组装软骨类器官数量调整培养基体积（每个组装软骨类器官2mL）。
5.5 动物实验
1周DMEM阶段后，Pa-TEC（每只小鼠最多4个）皮下植入无胸腺CD1 nu/nu雌性裸鼠。在巴塞尔市州兽医办公室许可下进行手术。
5.6 流式细胞术分析
为识别ASCs源性软骨类器官内间充质干细胞群体，在d0、4周、8周和12周培养时进行流式细胞术分析。
5.7 全片染色
ASCs源性软骨类器官4%多聚甲醛4°C固定过夜。固定后，样品清洗一次，PBS保存直至染色。
5.8 上清液中sGAG释放
软骨类器官上清液在软骨形成分化阶段每周收集，量化释放可溶性sGAG。
5.9 微型计算机断层扫描
微型计算机断层扫描（microCT），固定样品使用高分辨率扫描仪获取，0.5mm铝过滤X射线。
5.10 组织学染色与图像采集
组织学分析，固定样品必要时15% EDTA溶液脱钙，石蜡包埋。
5.11 QuPath和FIJI图像量化
使用开源软件QuPath v0.3.2进行组织分类为四类：骨、骨髓、软骨和其他。
5.12 三点生物力学测试
样品机械测试使用UMT Tribolab，力测量以恒定预定冲压速度0.01mm/s进行。
5.13 弹性模量计算
基于三点弯曲测试数据，使用公式确定弹性模量E。
5.14 统计分析
所有统计分析使用GraphPad Prism version 10.4.1进行。组间差异采用单因素方差分析，随后适当情况下Tukey事后检验进行多重比较。
