利用HMnO?纳米颗粒作为DNA损伤放大剂，以优化基于OXA的经动脉输注化疗效果

《Biomaterials》：Harnessing the HMnO 2 nanoparticles as the DNA injury amplifier to improve the OXA-based trans-artery infusion chemotherapy

肝细胞癌治疗中，传统奥沙利铂经动脉化疗存在肿瘤摄取低、谷胱甘肽解毒及DNA修复激活等问题。本研究开发空心MnO2纳米颗粒负载奥沙利铂（PEI-HMnO2@OXA），利用肿瘤微环境酸性特性释放药物并激活自由基，结合谷胱甘肽耗竭和DNA修复通路抑制，实现协同抗癌效应。纳米颗粒尺寸增强肿瘤渗透与滞留，10-100倍提高肿瘤药物浓度，并作为pH-GSH响应型MRI造影剂实现治疗监测。实验验证其通过阻断多种DNA修复基因（如OGG1、ATM等）和维持氧化还原平衡，显著抑制肝细胞癌模型。该策略为动脉化疗提供了安全高效且可监测的递送系统。

　　

Xianting Sun|Cai Feng|Zongling Xiong|Yifei Yang|Hao Zhou|Tianming Wang|Xiaofen Wang|Shulin Liu|Sai Li|Peng Lei|Liangrong Shi|Weihua Liao

中南大学智能医学成像工程研究中心放射科，中南大学分子成像研究中心Furong实验室，国家老年疾病临床研究中心，中南大学湘雅医院，长沙，410008，中国

摘要

奥沙利铂（OXA）是肝癌经动脉输注化疗（TAIC）中的关键化疗药物。然而，其临床疗效常常受到多种因素的限制：肿瘤摄取不足、谷胱甘肽（GSH）介导的全身解毒作用以及细胞DNA修复机制的激活。本文介绍了一种装载有OXA的中空MnO₂纳米粒子（PEI-HMnO₂@OXA），以增强OXA的TAIC效果。酸性的肿瘤微环境促进了OXA的释放，并触发PEI-HMnO₂生成自由基。当与GSH耗竭结合时，这一级联反应导致了显著的DNA损伤。此外，PEI-HMnO₂通过阻断多个DNA修复基因与OXA产生了协同效应。另一方面，利用纳米结构的增强渗透性和滞留效应，与静脉注射或单一药物治疗相比，TAIC的肿瘤摄取量增加了10-100倍，抑制效果也更为明显。同时，PEI-HMnO₂@OXA能够实现药物分布和肿瘤状态的实时MRI监测，有助于治疗指导。通过使用不同的细胞系、小鼠和兔子模型以及患者来源的HCC OXA敏感/耐药类器官进行了综合实验，以阐明PEI-HMnO₂@OXA的肿瘤抑制作用，为癌症管理提供了新的见解。

引言

肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌，是全球癌症相关死亡的第三大原因。¹由于HCC独特的肝动脉血液供应特性，经动脉输注化疗（TAIC）已成为其治疗的重要组成部分。²基于奥沙利铂（OXA）的TAIC被推荐为多种国际指南中的有效策略，以改善HCC患者的预后，特别是巴塞罗那临床肝癌（BCLC）C期患者。³, ⁴尽管基于OXA的TAIC显示出显著的临床益处，但总体反应率仍不尽如人意，约为40-50%。⁴因此，迫切需要开发新的策略来提高TAIC的总体反应率。

OXA是一种DNA损伤剂，可以形成Pt-DNA加合物并破坏DNA复制叉，从而导致DNA复制和转录的失调，最终引发细胞死亡。⁵OXA化疗的临床疗效受到药物耐药性的发展和显著副作用的限制，这些因素决定了临床方案的组成和剂量。⁶, ⁷, ⁸现在人们认识到，肿瘤细胞内的OXA浓度、还原系统（如谷胱甘肽）的解毒作用以及DNA修复的激活对OXA化疗的治疗反应至关重要。⁹因此，OXA通常与辅助药物联合使用，这些辅助药物旨在抑制DNA修复、提高OXA的摄取或消除GSH，以增强治疗效果。¹⁰, ¹¹, ¹², ¹³FOLFOX方案就是这一原则的典范，作为多种恶性肿瘤（包括肝细胞癌）的一线化疗方案。¹³, ¹⁴, ¹⁵该方案将奥沙利铂与5-氟尿嘧啶（5-FU）结合使用，后者是一种氟嘧啶类似物，从而抑制DNA合成。亚叶酸钙通过促进细胞内叶酸复合物的形成来增强这一效果，从而延长DNA修复的抑制时间并增强OXA的细胞毒性。¹⁵然而，FOLFOX疗法也存在基于铂类药物的局限性：包括肿瘤摄取不足、累积性神经毒性、药物分布难以追踪以及获得性多重耐药机制。¹⁶因此，提高基于OXA的TAIC效率的合理策略应包括改善药物摄取、阻断GSH介导的解毒和DNA修复等耐药机制、实现实时追踪药物分布，并尽量减少全身副作用。

肿瘤组织中DNA修复途径常常过度表达，这与无病间隔期（DFI）缩短相关，而无病间隔期是治疗效果的关键指标。¹⁷, ¹⁸, ¹⁹因此，靶向抑制DNA修复有望成为改善肿瘤治疗预后的有效策略。²¹, ²², ²³细胞DNA修复机制包括六个主要途径：范可尼贫血途径（FA）、²⁴错配修复（MMR）、¹⁹碱基切除修复（BER）、¹⁷核苷酸切除修复（NER）、¹⁵同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）途径。这些途径包含对基因毒性压力作出反应的DNA损伤传感器，以及与合成和复制相关的基因。一旦传感器被激活，这些启动因子将作为一个相互连接的网络，招募下游蛋白质共同识别和切除受损的DNA区域。然后它们形成一个保护性支架并合成无错误的替代片段，以恢复基因组完整性并确保细胞存活。²⁴迄今为止，已经发现许多能够靶向抑制DNA修复途径关键基因的药物可以增强肿瘤治疗效果，例如用于抑制多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的奥拉帕利布（²⁵）、用于抑制HR修复的YU238259¹⁷，以及用于抑制增殖细胞核抗原（PCNA）的AOH1996¹⁷, ²⁶临床前研究证实，OXA与DNA修复抑制剂的组合可以在体外和体内针对多种癌症提高其化疗效果。¹⁰, ²⁷, ²⁸例如，一项结合PARP抑制剂（奥拉帕利布）和DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）抑制剂的临床前研究表明，这种组合在小鼠和患者来源的异种移植模型中协同抑制了肝细胞癌（HCC）²⁹。然而，目前报道的药物主要效果有限，通常只针对单一基因，因此仅适用于具有特定突变的患者亚群。³⁰这种狭窄的特异性使它们容易受到耐药机制的影响，因为不同DNA修复途径之间的相互作用可以绕过其效果。癌细胞在应对基因毒性压力时在修复机制之间切换的动态能力已有充分记录。¹⁹, ³¹, ³²因此，实现深远且持久的抗肿瘤目标仍然是一个重大挑战。迄今为止，已经开发出一些创新的纳米生物技术策略，通过克服多种DNA修复途径来改善放疗或化疗的效果。³³, ³⁴然而，仍需要一种高度生物安全的策略，以便将其从实验室转化为临床应用。

本研究提出了一种基于Mn²⁺的纳米工程制剂来克服OXA化疗的局限性。为此，我们开发了一种装载有OXA的聚乙二醇亚胺（PEI）修饰的中空MnO₂纳米粒子（命名为PEI-HMnO₂@OXA），以增强肿瘤特异性经动脉输注化疗（TAIC）的效果。作为概念验证研究，选择了HCC作为肿瘤模型，因为该模型具有DNA修复相关基因的过度表达和高耐药倾向（图S1）。³⁵, ³⁶与传统的基于小分子药物的化疗方法不同，这种结构具有以下吸引人的优势：i) 工程化的PEI-HMnO₂@OXA驱动的肿瘤DNA损伤诱导剂可以通过阻断从损伤检测基因到DNA合成基因（如OGG1、ATM、ATR、PCNA、XPC、RAD52、PRPA2、UNG、LIG4等）的多个DNA修复相关基因，产生强烈的协同效应，最终抑制所有DNA修复相关途径，从而使受损DNA无法及时修复，从而持续增强化疗效果，触发HCC细胞死亡；ii) 带正电的PEI-HMnO₂@OXA可以被肿瘤细胞轻易吞噬，HMnO₂可以逐渐被GSH和酸性微环境分解，释放出Mn²⁺和OXA，进而破坏细胞内的氧化还原平衡，从根本上切断GSH的解毒作用，加剧DNA损伤，最终促进肿瘤死亡。³⁷, ³⁸为了探索更广泛的应用性，引入了患者来源的OXA敏感和耐药的HCC类器官，以及两种具有高DNA修复塑性的癌细胞系（包括小鼠结肠癌细胞CT26和小鼠乳腺癌细胞4T1），以验证其抗癌效果。无论个体间DNA修复相关突变的异质性如何，这些模型中都观察到了改进的抗肿瘤现象。我们将TAIC纳入到PEI-HMnO₂@OXA的靶向递送中，在兔子耳动脉附近建立的HCC模拟肿瘤模型中进行测试（方案1）。³⁹, ⁴⁰, ⁴¹, ⁴²得益于PEI-HMnO₂@OXA的纳米级尺寸，与自由OXA治疗相比，肿瘤对OXA的摄取量增加了十倍，抗肿瘤效果更显著，副作用更低，从而最小化了脱靶效应。此外，PEI-HMnO₂@OXA可以作为pH和GSH响应的T₁ MRI造影剂⁴³，允许非侵入性地实时监测药物分布和降解情况，以及治疗过程中的肿瘤生长状况。通过全面的体外和体内实验验证了所提出策略的抗肿瘤效果和机制。鉴于这些优点，PEI-HMnO₂@OXA与TAIC的结合代表了靶向治疗实体瘤的有希望的范例，具有广泛的临床转化潜力。

合成与表征

PEI-HMnO₂@OXA纳米粒子的制备过程如图1所示。首先，使用介孔SiO₂纳米粒子作为硬模板。在超声作用下，通过KMnO₄与SiO₂反应，在SiO₂表面原位生长一层均匀的MnO₂，形成SiO₂@MnO₂核壳结构。然后使用2 M Na₂CO₃溶液在12小时内溶解固体SiO₂核心，得到HMnO₂。随后进行PEI修饰并装载OXA，最终得到PEI-HMnO₂@OXA

结论

总之，我们提出了一种新的协同治疗策略，结合了DNA修复抑制和失调的氧化还原稳态（OXA耐药性的两个关键驱动因素）以及经动脉输注，以提高HCC中OXA化疗的效果。这种治疗方法具有多个独特优势，使其成为临床实践中的有希望的候选方案，适用于其他需要TAIC的多种肿瘤类型（表S2）。首先，

材料

本研究中使用的溶剂和试剂均来自商业公司。平均直径为50 nm的介孔二氧化硅来自Shiyanjia Biomedical Technology Co., Ltd。KMnO₄、Na₂CO₃和OXA来自Aladdin。Sigma-Aldrich提供了PEI（25000）。2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯（DCFDA）和GSH检测试剂盒来自Solarbio。Hoechst 33342来自Servicebio。TUNEL检测试剂盒和γH2AX检测试剂盒以及线粒体膜电位检测试剂盒也来自Servicebio。

CRediT作者贡献声明

Liangrong Shi：资源、方法学、研究、数据分析。Peng Lei：撰写——初稿、可视化、验证、监督、软件、项目管理、方法学、研究、资金获取、数据分析、概念化。Cai Feng：验证、项目管理、方法学、概念化。Weihua Liao：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取、数据分析。Xianting Sun：撰写——审阅与编辑，

未引用参考文献

[53], [67]。

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可向通讯作者索取。

伦理批准声明

健康的新西兰兔子（1.5-2公斤）来自xxx Taiping Biotechnology Co. Ltd。动物相关处理方法获得了第二湘雅医院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（20231309）。肝癌患者的肿瘤组织来自我们自己的部门，这些患者接受了FOLFOX-HAIC治疗，研究程序获得了湘雅医院审查委员会和伦理委员会的批准（病例编号202208190）。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（U25A20137、82471984、82071894、82201487）、中国博士后科学基金（2022TQ0377）、湖南省科技创新计划（2020RC4007）、湖南省自然科学基金（2022JJ40820、2024JJ6687、150110090、512340065）、长沙自然科学基金（KP2403036）以及Furong实验室2024PT5110科学研究计划的支持。