设计和评估具有“茎-环-链”结构的DNA适配体，用于中和蓖麻毒素和Abrin的毒性作用

《Bioorganic Chemistry》：Design and evaluation of DNA aptamers with “stem-loop-chain” structures for spectrum neutralization of ricin and abrin

Ricin和abrin毒素作为Type II RIPs，威胁公共安全且无现有疗法。本研究设计具有"茎环链"结构的DNA aptamer，通过模拟天然底物结合位点有效抑制两种毒素的N-糖苷酶活性，并在细胞和动物模型中验证了C-1 aptamer的广谱抑制效果及高亲和力。

Zhenfang Xu|Jiawei Zhang|Shuangshuang Liu|Xiwei Wang|Yunhui Chen|Feiyan Wang|Xueling Ma|Weiguo Shi|Aiping Zheng|Jianchun Li|Liang Xu

蚌埠医学院药学院，中国蚌埠233030

摘要

蓖麻毒素和相思豆毒素被归类为II型核糖体失活蛋白（RIPs）毒素，对公共安全和生物恐怖主义事件构成重大威胁。它们通过特异性识别核糖体rRNA的α-肉毒杆菌/蓖麻毒素环（SRL）中的高度保守结构域，发挥催化N-糖苷酶活性，从而抑制蛋白质合成并最终诱导细胞死亡。目前，尚无针对II型RIPs的许可药物，因此开发具有广谱活性的解毒剂显得十分迫切。在本研究中，我们设计了一系列具有“茎-环-链”结构的DNA适配体，以模拟天然底物，实现对蓖麻毒素和相思豆毒素的广谱抑制。结果表明，大多数适配体在分子和细胞筛选模型中均能有效抑制这两种毒素的活性。最优适配体C-1能够高效内化到细胞中，并对这两种毒素具有高亲和力结合。在细胞中毒保护实验中，C-1的IC50值分别为80.2±26.8 nM（针对蓖麻毒素）和282.8±19.5 nM（针对相思豆毒素）。在ICR小鼠模型中，C-1组的存活率显著高于对照组。这项工作提供了具有潜在广谱抑制活性的新型适配体基先导化合物，并为开发针对其他生物毒素的治疗药物建立了技术框架。

引言

蓖麻毒素和相思豆毒素作为典型的II型核糖体失活蛋白（RIPs），因其强烈的毒性和易获取性而成为持续的全球生物威胁[[1], [2], [3]]。过去几十年中，这些毒素在众多恐怖事件中的使用促使疾病控制与预防中心（CDC）将它们列为B类危险品[4]。1980年至2020年进行的全球范围流行病学研究表明，意外中毒主要通过摄入途径发生。摄入5-20颗蓖麻籽可引发急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和多器官衰竭，报告的死亡率高达12%[5]。

II型RIPs具有保守的异二聚体结构，由一个具有rRNA N-糖苷酶（EC 3.2.2.22）活性的酶A链（蓖麻毒素A链，RTA/ATA；约32 kDa）和一个半胱氨酸键连接的半乳糖特异性凝集素B链（蓖麻毒素B链，RTB/ATB；约34 kDa）组成[[6], [7], [8]]。细胞毒性途径始于B链与细胞表面受体的结合，随后通过内吞作用转运至内质网（ER）[9]。在内质网腔内，半胱氨酸键断裂释放A链，A链利用内质网相关降解（ERAD）机制进入细胞质[10,11]。A链催化核糖体rRNA的α-肉毒杆菌/蓖麻毒素环（SRL）中腺嘌呤的脱嘌呤化[12,13]。这一主要机制与氧化DNA损伤和细胞凋亡等次要途径协同作用，使得这些毒素具有显著的细胞毒性，单个A链每分钟可脱嘌呤化多达1500个核糖体[14,15]。

针对II型RIPs的解毒剂研发仍面临诸多挑战。由于催化亚基（RTA）的活性位点庞大且极性强，难以用小分子进行靶向，现有抑制剂通常效力较低[16]。尽管单克隆抗体是一种有前景的治疗方式，但其无法进入细胞内部，从而无法在中毒后中和RTA[17]。RiVax?和RVEc?等疫苗候选物已进入I期临床试验；然而，这些疫苗诱导的抗体作用时间较短，限制了其广泛应用[18]。从研究和商业角度来看，寻找广谱抑制II型RIPs的抑制剂具有重要的战略意义。能够对抗多种毒素的单一治疗药物将具有经济优势，并提高应对新兴威胁的能力。然而，这一领域仍处于起步阶段；尽管有少数研究报道了针对II型RIPs保守元素（如催化残基Glu177/Arg180）或干扰毒素吸收的小分子，但这些先导化合物的效力尚未得到优化[[19], [20], [21]]。

适配体是一种能够折叠成特定三维构象的寡核苷酸，能与目标高亲和力、高特异性结合，因此常被称为“化学抗体”。其优点包括体外合成简单、分子量低、易于化学修饰和环境稳定性高，使其在生物成像、药物递送和分析化学中得到广泛应用[22]。像Izervay?这样的药物的成功上市突显了其作为治疗剂的潜力[23]。它们在检测II型RIPs方面的有效性已有充分记录；例如，一种经过QSAR优化的传感器实现了750 fg/mL的检测限（Liu等人）[24]。然而，这种诊断成功尚未在治疗效果方面得到验证，尤其是在广谱中和方面。

模仿内源性底物是药理学设计的基本原则。II型RIP毒素的毒性机制依赖于它们对核糖体rRNA中高度保守的“茎-环-链”基序的识别。这种结构保守性为开发广谱抑制剂提供了合理依据。在本研究中，我们假设具有“茎-环-链”拓扑结构的DNA适配体可以模拟rRNA的局部底物构象，实现非序列特异性的广谱抑制（图1）。这些DNA支架结合了天然RNA底物的结构相似性和改进的生物稳定性。通过引入碱基替换和长度变化，增加了分子的多样性。该方法的有效性通过多层次系统进行了全面评估——包括分子相互作用、细胞毒性抑制以及在动物模型中的保护效果——最初针对蓖麻毒素和相思豆毒素，随后对主要候选化合物进行了机制研究。

材料与仪器

蓖麻毒素和相思豆毒素购自北京汉普药用生物学研究所（中国北京）。这些毒素为天然提取物，其纯度通过SDS-PAGE分析确认≥95%。使用的批号为蓖麻毒素HP370113620250526，相思豆毒素HP370117020250423。BEAS-2B细胞来自国家细胞系资源库（中国北京）。Cell Counting Kit-8（CCK-8）购自叶森生物技术有限公司（中国上海）。所有

适配体的设计与合成

II型RIPs的毒性源于它们对核糖体rRNA中腺嘌呤碱基的特异性水解。传统上，目标序列被认为是SRL顶端的GAGA序列，对应于人类28S rRNA的A4566位、大鼠28S rRNA的A4324位、酵母25S rRNA的A3027位以及原核生物23S rRNA（例如大肠杆菌）的A2660位（表S1）[[29], [30], [31], [32]]。这些关键位点及其侧翼序列具有显著的结构保守性。使用mFold

总结与展望

本研究设计了具有“茎-环-链”结构的DNA适配体，旨在模拟天然底物的结合特性，并对II型RIPs发挥潜在的广谱抑制作用。优选适配体C-1在分子和细胞水平上均表现出强大的中和效果，主要通过竞争性结合毒素的活性位点并抑制其N-糖苷酶活性。在多种动物模型中，C-1

CRediT作者贡献声明

Zhenfang Xu：撰写原始稿件、可视化处理、验证、软件应用、项目管理、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构建。Jiawei Zhang：撰写原始稿件、验证、软件应用、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构建。Shuangshuang Liu：软件应用、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构建。Xiwei Wang：软件应用、方法学设计、实验研究。Yunhui Chen：软件应用、方法学设计、实验研究。

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。