支链氨基酸（BCAAs）包括必需氨基酸l-缬氨酸（Val）、l-亮氨酸（Leu）和l-异亮氨酸（Ile），是哺乳动物生理过程的基本营养素，在代谢调节、免疫功能和疾病调控中起着关键作用（Siddik & Shin, 2019）。大量研究表明，BCAAs作为重要的代谢调节因子，影响脂肪分解和合成（Nishimura et al., 2010）、葡萄糖代谢和转运（Doi et al., 2003）、肠道屏障完整性和营养吸收（Sun et al., 2015）以及胚胎发育（Teodoro et al., 2012）。新的证据揭示了BCAAs的更多生理功能：它们通过改善局部氨基酸转运能力增强肠道健康，通过增加β-防御素表达和细胞因子谱的改变增强免疫力，并可作为慢性疾病（包括糖尿病和胰岛素抵抗）早期检测的潜在生物标志物（Newgard et al., 2009, Zhang et al., 2017）。然而，哺乳动物缺乏BCAAs的合成能力，必须完全从饮食中获取。因此，在动物饲料中战略性地补充BCAAs可以为细胞增殖和发育提供必要的营养支持。这种方法可以显著降低饲料中的粗蛋白含量，同时提高饲料利用率（Han et al., 2019），从而推动了全球饲料配方中BCAAs添加量的快速增加。
近年来，人们利用微生物作为宿主细胞和可再生生物质作为原料，探索了BCAAs的工业生产（Zhang et al., 2021, Zhang et al., 2021）。多种微生物菌株，主要是Corynebacterium glutamicum（Yu et al., 2021）和Escherichia coli（Ding et al., 2023），被用于BCAAs的生产。BCAAs的生产效率往往受到微生物代谢调节和合成能力的限制。除了传统的通过突变筛选构建工程菌株的方法（Wendisch et al., 2006, Zhang et al., 2021, Zhang et al., 2021）外，通过消除限速酶的反馈抑制来促进代谢通量，并维持细胞内的氧化还原平衡，已成为构建所需产品的常规步骤（Feng et al., 2018, Wang et al., 2013, Wang et al., 2022, Wang et al., 2022）。最近，新的工程工具和分析技术的出现进一步提高了BCAAs生物合成的效率，包括测序技术、高通量筛选设备（Lv et al., 2021）、分子生物传感器（Eggeling et al., 2015）、多变量模块化工程（Zhang et al., 2022）和组学方法（Crown et al., 2015）。然而，生物质产量与生产效率之间的平衡无疑是高效BCAAs合成的核心问题。构建高效的微生物细胞工厂仍然面临诸多挑战。此外，从发酵系统中分离和纯化这些氨基酸产物需要额外成本，使得BCAAs的生产和应用对环境不利。近年来，单细胞蛋白（SCP）研究的持续进展为在SCP中复合形式生产BCAAs提供了可行的选择。P. pastoris是生产富含BCAAs的SCP的理想宿主，尤其是随着蛋白质数据库筛选和人工蛋白质设计技术的进步，这可以增强P. pastoris中高BCAAs含量蛋白质的表达（L & Vasu, 2020）。P. pastoris在食品技术中的应用最重要的突破是获得了美国食品药品监督管理局（FDA）的普遍认可的安全性（GRAS）认证，以及FDA对重组蛋白的批准（Vijayakumar & Venkataraman, 2024）。此外，P. pastoris的发酵过程是一种经济高效且方便的方式，可以生产食品级质量的代谢产物，其生长和代谢产物的生产已在使用廉价工业原料甲醇的培养基中得到验证（Gao et al., 2022），因此可以认为这是一种经济环保的BCAAs生产系统。在P. pastoris发酵中使用工业副产品可以吸引更多人关注这些发酵过程的规模化（Gao et al., 2023, Meng et al., 2023）。
在本研究中，我们首先利用合成生物学技术改造了P. pastoris中的BCAAs生物合成途径，成功构建了一种高BCAAs产量的菌株。然后，我们结合了人工智能，使用Pichia pastoris蛋白质表达增强预测模型（PMPEPE）筛选出在P. pastoris中高表达且富含BCAAs的内源性蛋白质。通过结构引导的氨基酸替换，我们设计了一种BCAAs含量为35%的蛋白质。通过结合代谢工程和AI驱动的蛋白质设计，我们显著提高了BCAAs的生产效率。
