《Chemico-Biological Interactions》：A single cell transcriptomics-based analysis provides mechanistic insights into the chronic low-concentration effects on hematopoietic disruption in zebrafish(Danio rerio) by Antinomy
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慢性低剂量锑暴露通过代谢紊乱和炎症反应导致斑马鱼肾损伤及造血失衡
孙园意|岑中乾|刘世瑞|杨爱江|张景云|李青|胡霞|侯正婷
贵州大学资源与环境工程学院，教育部喀斯特生态环境观测与研究站，教育部喀斯特地质资源与环境重点实验室，中国贵阳550025
摘要
锑（Sb）是一种广泛使用的战略金属，由于其环境持久性和潜在毒性而引起了越来越多的关注。然而，低浓度锑暴露对造血功能的长期影响仍知之甚少。在本研究中，斑马鱼（Danio rerio）被暴露于0、5、50、500和5000 μg/L的锑浓度下28天，以探讨其血液毒性效应及其潜在机制。生化检测显示，锑暴露显著干扰了血糖和脂质代谢，降低了血糖水平，并以浓度依赖的方式改变了脂质谱型。此外，锑暴露还增加了NFAT、M-CSF和IL-11等细胞因子的表达。组织病理学检查发现斑马鱼的肾脏（主要造血器官）受到明显损伤。单细胞RNA测序鉴定出了13种造血细胞群体。差异表达基因主要富集在IL-17通路中，伴随着NF-κB的下游激活以及TNF-α和MMP-9的表达增加。这些发现为锑诱导的造血失衡和肾脏损伤提供了机制上的见解，强调了IL-17介导的炎症反应在锑毒性中的作用。总体而言，本研究为锑污染的生态风险评估和健康危害评估提供了有价值的参考。
引言
锑（Sb）作为一种关键的战略金属，被广泛应用于工业制造、医疗应用、军事产品、能源和环境技术（Herath等人，2017年；Yang等人，2021年）。消费量的增加导致环境中锑负荷增加，引发了对环境安全的担忧。
鉴于锑污染带来的重大生态风险和潜在的人类健康危害，全球实施了严格的环境质量标准。美国环境保护署（EPA）将饮用水中锑的最大允许浓度设定为6 μg/L，而中国则对生活饮用水、三类地表水和地下水实施了更严格的标准，即5 μg/L。中国拥有全球最大的锑储量，占全球总量的48%以上。值得注意的是，中国的西南地区负责全球80%以上的锑生产，其中湖南省的锡矿是世界最大的锑矿床。长期的大规模采矿在该地区造成了严重的锑污染。环境介质中的锑浓度经常超过监管限值；据报道，水柱中的锑浓度高达29.4 mg/L（背景水平约为1 μg/L）（Li等人，2016年）。当水生生物暴露于含锑的水中时，锑可以通过多种途径被吸收并随后在其组织和器官中积累，最终引发一系列不良的毒理学效应（Zou等人，2022年）。
越来越多的证据表明，一旦被吸收，锑会与血红蛋白和其他红细胞蛋白结合，从而促进其在体内的系统运输和分布（Wu等人，2018年）。长期锑暴露会导致其在组织中的逐渐积累，对心脏、胸腺、脾脏和垂体等多个器官造成慢性损伤。这种积累进一步促进了肝脏、神经系统和心血管系统的疾病发展，可能导致毒性甚至致癌（Lai等人，2022年；Wysocki等人，2023年；Yang等人，2021年）。早在20世纪70年代，许多研究就报告了锑对血液及相关生化参数的影响。锑可以通过胃肠道吸收进入血液，或在实验条件下通过静脉注射进入血液（Felicetti等人，1974年）。在肾脏中，锑可诱导血红素加氧酶活性，据报道在125 μmol/kg浓度下可增加11倍（Drummond & Kappas，1981年）。长期通过饮用水暴露于锑与碱性磷酸酶（ALP）活性轻微下降有关（Poon等人，1998年）。关于三氧化二锑（Sb?O?）纳米颗粒的研究表明，5 μg/mL的Sb?O?纳米颗粒对红系细胞群落形成具有特异性毒性，抑制了红系前体细胞的增殖（Bregoli等人，2009年）。在中国的人群研究中，锑暴露与肝脏酶和胆红素的变化有关，血浆中的锑浓度与血清总胆红素水平呈正相关（You等人，2020年）。我们之前的研究表明，锑暴露会导致斑马鱼血脑屏障中的红细胞溶血。在16.58 mg/L的锑浓度下，细胞组织间出现广泛的空泡化，基底层受到破坏，血管内皮细胞、红细胞和基底层之间的边界变得模糊（Xu等人，2024年）。在33.16 mg/L的锑浓度下，差异表达基因主要富集在造血细胞谱系中（Yao等人，2023年）。这些观察结果表明，锑对造血系统有显著影响；然而，其潜在机制仍不清楚。
斑马鱼是一种理想的实验模型，因为它们的造血器官是肾脏，这与哺乳动物的骨髓相对应。斑马鱼的造血系统包括红系、髓系、淋巴系和巨核系细胞谱系，其相关的转录因子和信号通路与人类高度同源。这些特征使得斑马鱼在研究人类造血系统和血液疾病方面具有广泛的应用价值（Gore等人，2018年；Kobayashi等人，2019年；Konantz等人，2019年）。同时，高通量单细胞RNA测序（scRNA-seq）已被证明是研究脊椎动物造血细胞类型异质性的强大工具（Chongbin等人，2024年；Rubin等人，2021年；Tang等人，2017年）。
鉴于锑污染的生态风险和健康危害，长期低剂量锑暴露的血液毒性效应仍知之甚少。因此，我们假设长期暴露于环境相关浓度的锑会通过改变代谢平衡和诱导肾脏中的炎症反应来破坏斑马鱼的造血稳态。近年来，高通量单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）已成为研究脊椎动物物种造血细胞异质性的强大工具。因此，本研究采用了这种方法来探讨长期低浓度锑暴露如何破坏斑马鱼的造血功能。
实验部分
斑马鱼的饲养和暴露
本研究中使用的三个月大的斑马鱼来自中国上海。实验前，成年斑马鱼在实验室条件下适应了14天，死亡率低于1%。水温为26.00 ± 1.00 °C；pH值为7.08–7.98；溶解氧为6.40–7.50 mg/L。鱼每天在09:00和17:00喂食两次，处于恒定的12小时光照/12小时黑暗周期中。选择长度为3–5厘米、体重为0.25–0.35克的鱼进行实验。
锑暴露后斑马鱼血脂的变化
图1A–D显示了锑暴露后斑马鱼脂质谱型的变化。总体而言，与对照组相比，锑暴露组的脂质水平下降。T-CHO表现出浓度依赖性趋势，最初随着锑浓度的增加而下降，随后又上升。测得的T-CHO水平分别为0.22 ± 0.006 mmol/L、0.14 ± 0.0007 mmol/L、0.15 ± 0.0028 mmol/L、0.16 ± 0.0007 mmol/L和0.18 ± 0.008 mmol/L（图1A）。如图1B所示，锑暴露改变了TG
讨论
本研究通过生化检测、组织病理学分析和单细胞测序系统地研究了锑暴露对斑马鱼造血系统的长期影响。我们首次提供了证据，证明长期暴露于低浓度锑（28天）可以显著干扰脂质代谢，损害葡萄糖稳态，并改变多种细胞因子的水平，最终导致主要造血器官肾脏的病理变化
结论
本研究表明，长期锑暴露通过代谢紊乱、细胞因子失调和肾脏结构损伤破坏了斑马鱼的造血稳态。生化和组织病理学分析显示血糖、血脂谱型和细胞因子水平发生了显著变化，而单细胞RNA测序发现了造血细胞数量的变化，并强调了IL-17信号通路在介导锑诱导的功能障碍中的作用。
作者贡献声明
岑中乾：撰写——审稿与编辑、验证、正式分析、概念化。孙园意：撰写——初稿、方法学、研究、正式分析、数据管理、概念化。胡霞：资金获取。李青：方法学、研究。侯正婷：撰写——审稿与编辑。刘世瑞：撰写——审稿与编辑、验证、正式分析、概念化。张景云：撰写——审稿与编辑、验证、正式分析、概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了贵州大学的环境科学与新技术新博士建设项目资金（编号：060005）和贵州省教育科技创新团队（Qian Jiao Ji[2023]056）的支持。部分图像使用Figdraw制作。
