《Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics》：Comparative transcriptomic analysis across ovarian developmental stages in
Sepiella japonica provides novel insights into its molecular regulatory mechanisms
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分子机制研究揭示雌性短蛸卵巢发育四阶段的转录组动态及关键调控基因 | Sepiella japonica | RNA测序 | 卵巢发育阶段 | 差异表达基因 | KEGG通路富集
徐安|吕振明|刘静|刘天伟|于静|杨一静|黄坤|龚莉|李凤辉|朱登辉|平洪玲|史慧来|刘丽琴
浙江海洋大学海洋科学与技术学院海洋种质资源勘探与利用国家工程实验室，中国316022
摘要
Sepiella japonica是一种具有重大商业价值的头足类动物，广泛分布于中国沿海水域，从香港南部到朝鲜半岛以及日本西部地区均有发现。然而，在人工饲养条件下，S. japonica常常表现出性成熟提前现象，这会导致成年个体的体型变小，严重限制了水产养殖的发展。因此，阐明卵巢发育的分子机制已成为当务之急。本研究对处于四个关键卵巢发育阶段的S. japonica雌性个体的卵巢组织进行了RNA测序：卵母细胞生成阶段（阶段I）、原生质生长阶段（阶段II）、间质生长阶段（阶段III）和滋养质生长阶段（阶段IV）。从16个样本中获得了共计354,393,214条高质量读段（Q20值大于98.58%）。通过I与II、II与III、III与IV的成对比较分析，分别识别出10,050个、2,564个和2,278个差异表达基因（DEGs）。差异表达分析结果显示，有13,319个基因在四个发育阶段中均表现出一致的高表达水平，例如FOXL2、HSD17B2和BMP1，表明这些基因在调控S. japonica卵巢发育中起着关键作用。基因本体论（GO）富集分析显示，这些DEGs在蛋白质定向到内质网、雌性对雌二醇的反应、氧化磷酸化以及妊娠等过程中显著富集。KEGG通路分析表明，这些DEGs在核糖体、催乳素信号通路、FOXO信号通路和溶酶体等关键功能通路中显著富集。此外，“对雌二醇的反应”通路在多个发育阶段的比较中均表现出一致性富集，这表明与类固醇相关信号通路相关的基因可能在S. japonica的卵巢发育中发挥保守作用。本研究阐明了S. japonica不同卵巢发育阶段的转录表达调控及分子机制，为提高软体动物水产养殖的繁殖效率提供了理论指导。
引言
Sepiella japonica是一种具有商业价值的头足类动物，栖息于中国沿海水域，因其高营养价值而具有巨大的水产养殖潜力。然而，自20世纪80年代以来，由于过度捕捞，其种群数量急剧下降（Wu等，2010；Jiang等，2014）。近年来，随着人工繁殖和大规模养殖技术的进步，中国S. japonica的产量显著增加（Dong等，2010）。然而，在人工繁殖过程中，S. japonica会表现出性成熟提前现象，这限制了水产养殖的可持续发展（Wu等，2010）。先前的研究表明，雌性卵巢的过早发育是导致性成熟提前的关键因素（Zheng等，2010）。因此，阐明卵巢发育的分子机制至关重要。迄今为止，关于头足类动物卵巢发育的分子基础的研究主要集中在克隆和功能鉴定一些关键基因上，如类固醇、激素和肽类（Yan等，2016；Lü等，2016a；Liu等，2022；Lü等，2022a；Lü等，2022b）。然而，仅针对单个基因的研究不足以全面揭示S. japonica卵巢发育的分子调控机制。下一代测序（NGS）技术的出现极大地推动了非模式物种的转录组学研究和基因表达分析。其低成本和高测序产量使得生成大规模数据集成为可能（Meng等，2015）。最近，RNA测序（RNA-Seq）技术被广泛应用于多种水生动物中，用于分析不同发育阶段的基因表达模式和组织特异性功能。例如，对Chlamys farreri、Procambarus clarkii和Monopterus albus卵巢组织在不同发育阶段的转录组分析，鉴定出多个关键基因和信号通路，为这些物种卵巢成熟的分子机制提供了重要见解（Cai等，2017；Xu等，2020；Zhong等，2021）。在Litopenaeus vannamei、Gigantidas haimaensis和Macropodus opercularis等物种中，生殖腺转录组分析鉴定出与性别分化和生殖发育相关的几个关键基因，包括SOX9、FEM-1、BLIMP1和FOXL2（Peng等，2015；Shi等，2022；Liu等，2023）。在Scylla paramamosain中，睾丸和卵巢的比较转录组分析揭示了一些组织特异性基因，包括VASA、FEM-1、GPR30和WNT4，为该物种的功能基因组学研究提供了宝贵见解（Gao等，2014）。最近，RNA-Seq技术还被用于鉴定多种头足类动物中与卵巢成熟相关的基因，包括17β-HSD、Vtg-1、14-3-3ε-like、ZFR-like和Vtg-6，这些基因参与了卵巢发育的分子机制（Lü等，2016a；Zhang等，2023；Jiang等，2024）。
根据我们之前的研究，S. japonica的卵巢发育分为四个阶段：卵母细胞生成阶段（阶段I）、原生质生长阶段（阶段II）、间质生长阶段（阶段III）和滋养质生长阶段（阶段IV）（Lü等，2016b）。这些阶段代表了从早期卵细胞形成到最终成熟的关键生理转变过程，期间预计会发生显著的转录组变化。此前，我们的实验室已经组装并比较了S. japonica未成熟和成熟卵巢组织的转录组，提供了关于卵巢发育的重要基线信息。然而，这种两阶段比较不足以捕捉连续的转录动态或识别卵巢发育过程中的关键调控转变（Lü等，2016a）。为了更好地阐明S. japonica卵巢发育的分子机制并改进当前乌贼基因组的注释，我们采用了高通量测序技术，对四个不同发育阶段的S. japonica雌性个体的卵巢转录组进行了分析。识别出这些阶段的DEGs，并对其进行了富集分析，以阐明与卵巢发育和成熟相关的基因和通路。这些结果为研究乌贼卵巢发育的分子调控机制提供了新的见解，同时也为S. pharaonis的水产养殖中出现的性成熟提前现象提供了理论基础，从而减少了其对S. japonica养殖可持续性的负面影响。
样本收集
本研究从位于中国舟山西山岛的浙江省海洋渔业研究所的水产养殖站收集了代表四个卵巢发育阶段的S. japonica个体。根据我们之前的研究，将雌性卵巢发育分为四个阶段：卵母细胞生成阶段（阶段I）、原生质生长阶段（阶段II）、间质生长阶段（阶段III）和滋养质生长阶段（阶段IV）（Lü等，2016b）。共收集了四个个体
Sepiella japonica卵巢组织的转录组组装与注释
从四个阶段的16个样本中生成并测序了16个卵巢cDNA文库。共获得了354,462,345条原始读段，后续数据处理的统计结果总结在表2中。过滤后得到354,393,214条高质量读段，占原始读段的99.98%，平均每个样本约22,149,576条读段。Q20值介于98.58%至99.33%之间，Q30值介于95.85%至97.62%之间，GC含量介于38.17%至40.44%之间。
从初级卵细胞生长到早期卵黄发生的转变
从阶段I到阶段II的转变标志着S. japonica中卵泡发生的开始。在此阶段，卵母细胞经历快速的有丝分裂增殖，一部分生殖细胞进入减数分裂并停留在第一次减数分裂前期，初级卵细胞增大并被卵泡细胞包裹。这些过程反映了从生殖细胞增殖到早期卵泡形成的发育转变，需要广泛的转录、翻译和内分泌调控
结论
总之，本研究提供了涵盖S. japonica四个不同卵巢发育阶段的全面转录组数据集：卵母细胞生成阶段、初级生长阶段、间质生长阶段和滋养质生长阶段。通过比较转录组分析，共识别出13,319个DEGs。其中，一些与卵巢功能相关的关键基因被确定为卵巢发育的潜在调控因子，如FOXL2、HSD17B2、BMP1等
作者贡献声明
徐安：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，方法学，调查，正式分析，数据管理，概念构建。
吕振明：监督，资源获取，资金筹集。
刘静：调查，正式分析。
刘天伟：调查，正式分析。
于静：调查。
杨一静：调查。
黄坤：调查。
龚莉：资源支持。
李凤辉：资源支持。
朱登辉：调查。
平洪玲：资源支持。
史慧来：资源支持。
符合伦理标准
本研究遵循了中华人民共和国科学技术部制定的《实验动物照料和使用指南》（批准编号：2006–398），并获得了浙江海洋大学动物研究伦理委员会的批准，所有实验动物操作均符合相关规定。
资助
本研究得到了浙江省高校与科研机构基本研究经费（2024J005-2）和国家自然科学基金（42171069）的支持。
未引用的参考文献
Yamatoya等，2024
Zachos等，2002
利益冲突声明
作者声明没有可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
