基于无标记蛋白质组学分析的新鲜切割双孢蘑菇（Agaricus bisporus）在O?/CO?预处理下延缓褐变的研究

《Food Packaging and Shelf Life》：Study on delaying browning of fresh-cut Agaricus bisporus under O 2/CO 2 pretreatment based on label-free proteomics analyses

氧氮气预处理通过抑制多酚氧化酶活性及细胞壁降解酶表达，调控氨基酸和碳水化合物代谢途径，维持细胞壁完整性并降低呼吸速率，从而协同增强抗氧化能力并抑制褐变，为机制研究提供新视角。

梁王|张兴旺|刘志昌|刘环环|陈向燕|周清心|陈蕾蕾

山东省农业科学院食品与营养科学技术研究所/农业农村部新型食品资源加工重点实验室，济南250100，中国

摘要

O₂/CO₂预处理（OCP）能有效延缓新鲜切开的双孢蘑菇的褐变。然而，大多数研究集中在生理学方面，而基于蛋白质组学的研究较少。本研究采用蛋白质组学方法探讨了OCP对新鲜切开双孢蘑菇在储存过程中褐变的影响。OCP通过降低多酚氧化酶（PPO）的活性并抑制细胞壁降解酶来维持细胞壁的完整性，从而显著抑制了褐变。此外，OCP通过下调关键蛋白质（包括谷氨酸脱羧酶（GAD）、天冬氨酸氨甲酰转移酶（CAD）和酪氨酸酶（TYR）来减少氨基酸代谢。这种下调促进了酚类化合物的合成，增强了抗氧化能力，并抑制了酪氨酸的降解，从而抑制了黑色素的形成。同时，OCP通过下调几丁质酶（E3.2.1.14）、壳聚糖酶（csn）和半乳糖激酶（galK）等细胞壁水解酶来维持细胞壁的形态结构，减少了O₂的吸收并抑制了酶促褐变。OCP还降低了碳水化合物代谢，从而抑制了呼吸速率。此外，OCP通过上调乙酰辅酶A合成酶（acs）、丙酮酸脱氢酶（ace）、琥珀酸脱氢酶（frdA）和6-磷酸葡萄糖内酯酶（PGLS）、核糖-5-磷酸异构酶（rpiA）等蛋白质来促进能量代谢，为抑制新鲜切开双孢蘑菇的褐变提供了足够的能量。总之，本研究可能有助于我们更好地理解OCP对双孢蘑菇切片褐变延迟的作用。

引言

双孢蘑菇因其独特的质地、风味和营养价值而广受欢迎，占全球可食用真菌产量的15%（Fu等人，2023年）。随着生活节奏的加快，新鲜切开的果蔬因便利性、健康益处和新鲜度而具有越来越广阔的市场前景（Du等人，2024年）。然而，新鲜切割过程通常会导致切割表面褐变、水分流失、组织软化、微生物感染以及营养价值下降，从而缩短了新鲜双孢蘑菇的储存时间（Lei等人，2024年）。

褐变是新鲜切开的双孢蘑菇典型的品质劣化现象，其原因是酪氨酸和γ-L-谷氨酰-4-羟基苯（GHB）的酶促氧化形成黑色素。关于双孢蘑菇褐变的原因有两种解释：一种是新鲜切割会诱导酚类物质的产生，这些酚类物质被多酚氧化酶（PPO）氧化生成醌，醌进一步聚合形成黑色素（Zhang等人，2022a）。双孢蘑菇中有4条黑色素合成途径：邻氨基苯甲酸转化成PAP-黑色素、GHB-黑色素和DOPA-黑色素，而儿茶酚则转化成儿茶酚-黑色素（Weijn等人，2013年）。此外，酪氨酸酶的量、酶的作用形式和底物类型是双孢蘑菇褐变的关键因素（Jolivet等人，1998年）。

另一个原因是细胞完整性的破坏导致PPO与底物和O₂发生反应（Jolivet等人，1998年）。细胞壁结构的损伤是细胞完整性破坏的典型表现。由于缺乏果胶，双孢蘑菇的细胞壁降解主要由葡聚糖、几丁质和蛋白质的降解引起（Wang等人，2025b）。研究表明，几丁质酶、纤维素酶（Cx）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）和β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-GA）是细胞壁降解的关键酶。多项研究还表明，这些酶的高活性会导致蓝莓、芒果和葡萄等果蔬的细胞壁降解（Bangar等人，2022年）。完整的细胞壁结构可以减少O₂与底物的接触，因此进一步了解新鲜切开的双孢蘑菇的细胞壁代谢可能为抑制褐变提供新的方法。

此外，先前的研究表明，褐变还与膜脂质过氧化和活性氧（ROS）的积累有关；因此，提高采后果蔬的抗氧化能力可以有效抑制褐变（Wang等人，2025a）。许多研究还表明，较低的呼吸速率和稳定的能量供应也能抑制褐变（Lin等人，2024年）。研究表明，农产品的成熟和衰老与碳水化合物、能量和氨基酸代谢有关。具体来说，呼吸代谢在消耗碳水化合物、氨基酸和脂质等营养物质的同时也能产生能量。呼吸代谢的变化是对生物和非生物逆境的应激反应（Jacobo-Velázquez等人，2015年）。植物的呼吸途径主要包括糖酵解（EMP）、三羧酸（TCA）循环和戊糖磷酸途径（PPP）（Xue等人，2025年）。呼吸途径与能量代谢直接相关，因此许多研究集中在改变采后果蔬的呼吸代谢以抑制衰老。作为衰老的症状，褐变可能与上述代谢途径有关。因此，提高新鲜切开的双孢蘑菇的抗氧化能力和降低呼吸速率可能有助于抑制褐变。

O₂/CO₂处理已被广泛用于延长新鲜/新鲜切开的双孢蘑菇的储存时间（Wang等人，2022c）。先前的研究主要关注了不同O₂/CO₂条件下双孢蘑菇的生理和生化变化。我们之前的研究发现，OCP可以通过促进新鲜切开的双孢蘑菇的伤口愈合特性来延缓褐变（Wang等人，2022b）。然而，OCP对新鲜切开的双孢蘑菇褐变机制的研究尚未进行，尤其是在蛋白质组学层面。

多年来，蛋白质组学成功揭示了许多水果和蔬菜的保鲜机制，包括西兰花（Wang等人，2019年）、桃子（Jiang等人，2020年）和Flammulina filiformis（Fang等人，2020年）。传统的蛋白质组学技术主要是基于凝胶的定量方法，如二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2-D PAGE）和差异凝胶电泳（DIGE）。这些方法的优点是应用简单且数据获取迅速，但精度较低。无凝胶策略，如等压标签相对和绝对定量（iTRAQ）和串联质谱标签（TMT）标记，可以提高准确性，但会增加测试成本。无标签蛋白质组学是一种经济有效的工具，用于检测差异表达的蛋白质。Haseeb等人（2022年）使用无标签蛋白质组学研究了玉米中防御相关蛋白以抑制病原体感染。Fang等人（2020年）使用无标签高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）对F. filiformis进行了质量控制。然而，依赖无标签技术的双孢蘑菇蛋白质组学分析发表较少。

本研究使用新鲜切开的双孢蘑菇作为材料，分析了3小时OCP处理后褐变的生理指标和无标签蛋白质组学变化。本研究旨在探讨不同处理条件下双孢蘑菇储存过程中蛋白质表达的差异，通过蛋白质组学阐明OCP对新鲜切开的双孢蘑菇褐变的影响，并为进一步研究OCP抑制褐变机制提供理论基础。

章节片段

蘑菇制备和处理

蘑菇的制备和处理方法遵循我们之前的研究（Wang等人，2022a、Wang等人，2022b、Wang等人，2022c）。双孢蘑菇（As2796）于2022年4月15日从中国淄博市的实验田获得。双孢蘑菇在两小时内运输到实验室。经过5小时的黑暗预冷后，选择了约8.4公斤无物理损伤的双孢蘑菇样本进行实验。所有样本切成5毫米厚的片状，然后随机分组

OCP对新鲜切开的双孢蘑菇中L和BI的影响

新鲜切开的双孢蘑菇中的L和BI随着储存时间的延长而分别逐渐减少和增加（图1A和B）。具体来说，OCP显著抑制了L的减少和BI的增加。在8小时的储存时间内，对照组和OCP组的新鲜切开的蘑菇L分别减少了5.5%和4.4%，而BI分别增加了5.13倍和2.95倍。

OCP对新鲜切开的双孢蘑菇硬度和脆性的影响

两组新鲜切开的蘑菇在储存过程中的硬度均有所下降（图1C）。

讨论

新鲜切开的双孢蘑菇通常会缩短储存期，主要表现为褐变。OCP已被证明可以维持新鲜切开的双孢蘑菇的采后品质。我们之前的研究表明，3小时的OCP可以抑制褐变和水分流失，并保持新鲜切开的双孢蘑菇的营养价值（Wang等人，2022b、Wang等人，2022c）。然而，关于OCP下双孢蘑菇切片褐变机制的蛋白质组学分析研究尚未深入

结论

在本研究中，我们通过蛋白质组学全面研究了新鲜切开的双孢蘑菇在OCP条件下的褐变现象。结果表明，蘑菇片中的褐变是一个复杂的、相互关联的网络，涉及氨基酸、碳水化合物和能量代谢。OCP抑制了氨基酸代谢（如酪氨酸代谢），从而减少了黑色素的合成。OCP还抑制了碳水化合物的降解，维持了细胞壁的完整性，从而减少了O₂与底物的接触

CRediT作者贡献声明

刘环环：验证、软件处理。梁王：撰写——初稿、项目管理、数据分析、概念构思。张兴旺：可视化、方法学。刘志昌：可视化、方法学。陈蕾蕾：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取、资金申请。陈向燕：实验研究、数据分析。周清心：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、资源获取、项目管理、资金申请

利益冲突声明

我们声明与所提交的工作没有利益冲突。

致谢

本研究得到了国家重点研发计划（2024YFD2100100）、山东省农业科学院青年科学研究基金（CXGC2024D09）、济南市科技局（202228062）、山东省泰山学者计划（tstp20250544）以及山东省重点研发计划（2024TSGC0331）的支持。