《Gene》：Next-generation sequencing as an applicable method: from technical basis to use in medical diagnosis
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本文系统综述了NGS技术在医学诊断中的应用，包括产前筛查、癌症基因组学和遗传病检测，并分析了其技术优势与挑战，如数据解读和变异不确定性。
作者：阿曼·莫拉迪（Arman Moradi）、米娜·穆萨维（Mina Mousavi）、马吉德·马莱基（Majid Maleki）、赛义德·佐哈·塔巴塔巴埃（Seyedeh Zoha Tabatabaei）、马赫希德·马拉库蒂安（Mahshid Malakootian）
伊朗德黑兰塔比亚特莫达雷斯大学（Tarbiat Modares University）生物科学学院分子遗传学系
摘要
下一代测序（NGS）是一种高通量技术，能够确定基因组中核苷酸的序列。在过去几年中，基于NGS的方法为个体生命周期内及产前阶段的遗传疾病诊断和筛查提供了及时且经济有效的途径。通过产前筛查先天性异常，降低了遗传性疾病的发生率。利用基于NGS的方法早期检测遗传疾病有助于更好地管理这些疾病，从而提高患者的生活质量。NGS在药物遗传学和药物递送方面也发挥了关键作用，促进了更加个性化的医疗方式。基于NGS的方法越来越多地应用于基因组编辑，为提高编辑技术的精确度和有效性提供了重要信息。本文从技术角度介绍了各种基于NGS的方法的工作原理，并探讨了这些方法在诊断、筛查、药物遗传学和基因组编辑领域的应用及优势。
引言
人类基因组计划（HGP）始于1990年，当时使用桑格测序（Sanger sequencing）作为第一代技术来测序人类基因组。该计划获得的参考序列使科学家能够研究个体之间的遗传差异。多年来，科学家们利用桑格测序技术检测单个基因中的致病性遗传变异。虽然这种方法可以生成长达1000个碱基对（bp）的准确读段，但在分析具有复杂遗传结构的多个基因时需要大量工作且成本较高。（Bick和Dimmock，2011）这些方法的局限性迫切需要开发出能够以更低成本和更高速度分析大规模基因组区域的测序技术。
在高通量NGS平台出现之前，表示性差异分析（RDA）作为一种比较基因组学工具已经发展起来。这种方法使研究人员能够检测与疾病相关的序列和基因组片段的结构变化，为后续基于测序的方法奠定了基础。（Lisitsyn，1995；K?ks等人，2004）
“下一代测序”（NGS）这一术语描述了从第一代测序向大规模并行测序技术的转变。（Muzzey等人，2015）第一代中间测序方法——焦磷酸测序（pyrosequencing）通过光发射来检测核苷酸的掺入，但读长有限且可扩展性不足。（Mardis，2008；Jain等人，2016）第二代测序平台（狭义上的NGS）通过同时处理数百万个DNA片段实现了高通量测序。Illumina和Ion Torrent公司的短读长合成测序及半导体检测系统使得全外显子组测序（WES）、全基因组测序（WGS）以及多种靶向应用成为可能，且成本更低、速度更快。（Mardis，2017）
最近，通过Pacific Biosciences的单分子实时（SMRT）技术和Oxford Nanopore公司的第四代纳米孔平台，实现了数千到数百千碱基对的读长，同时消除了对DNA扩增的需求。（Hutchison，2007；Wheeler等人，2008；Rothberg和Leamon，2008；Meldrum等人，2011；Mardis，2008；Jain等人，2016；Mardis，2017；Lin等人，2021）这些连续的技术进步解释了为什么现代方法被称为“下一代测序”，因为它们从根本上改变了可获得的遗传信息的规模、速度和类型。
NGS技术彻底改变了遗传研究和医学诊断程序。WES和WGS的结合使研究人员能够研究基因组的全部蛋白质编码区域和非编码区域，有助于识别单核苷酸变异（SNVs）、小插入和缺失、拷贝数变异以及复杂的结构重排。（Nishiguchi等人，2013；Stavropoulos等人，2016；Lindstrand等人，2022；Ordo?ez-Labastida等人，2022）
这些新的诊断方法提高了识别复杂疾病遗传原因的能力，并发现了新的疾病相关基因。基于NGS的检测已成为生殖健康服务的标准手段，因为它们实现了非侵入性的产前检测（NIPT）以筛查染色体异常，以及体外受精（IVF）和胞浆内精子注射（ICSI）前的植入前遗传检测（PGT），有助于选择胚胎并提高妊娠成功率。（Alberry等人，2021；Yang等人，2023）
全球NGS市场分析间接反映了这些技术当前及未来的应用情况。最新报告显示，NGS市场持续快速增长，其中大部分测序量和支出集中在WES和WGS领域。NGS的两个主要应用领域是研究和临床诊断。在临床实践中，WES和WGS的应用最广泛且增长最快的三个领域是癌症基因组学、生殖健康（包括产前和植入前检测）以及遗传性罕见疾病。这些趋势表明NGS已融入常规护理，并对患者管理产生了显著影响。
本文全面概述了NGS在医学诊断中的应用，特别关注WES和WGS在癌症、生殖健康和遗传性疾病中的临床应用。首先总结了测序技术的发展及其技术原理，包括文库制备和数据分析的关键步骤，随后讨论了这些领域的主要临床应用，还简要介绍了其他重要用途，如药物遗传学、传染病诊断和基因表达分析。最后讨论了当前面临的挑战，包括变异解释、意义不确定的变异（VUS）的处理、伦理和经济考虑因素，以及基因表达的时间变化等新兴问题，并展望了NGS进一步融入常规临床实践的前景。通过将技术进步和市场采纳模式与具体临床应用联系起来，本文明确了基于WES和WGS的诊断方法的能力和局限性。
部分内容摘录
全球NGS市场和使用趋势
过去10年中，NGS市场迅速扩张，预计未来仍将保持高速增长。2024年NGS市场规模达到95.6亿美元，到2033年预计将增长至422.5亿美元，年均增长率约为18.0%。（2021年全外显子组测序市场规模）这种强劲增长得益于对先进基因组研究的日益增长的需求、NGS在临床诊断中的广泛应用以及技术的持续发展。
WES
近年来，全球多项研究表明WES在检测疾病遗传基础方面发挥着重要作用。（Malakootian等人，2022；Malakootian等人，2022）
WES是一种广泛使用的NGS方法，用于测序人类基因的编码区域，这些区域仅占人类基因组的不到2%（图1）。然而，大约85%的致病性变异位于这些区域。（van Dijk等人，2014；Kanzi等人，2020）
此外，WES还
WGS工作流程
WGS数据的分析与WES数据的分析非常相似，尽管在选择适合检测SNVs的工具方面存在差异。虽然已经开发出一些用于从WES数据中检测SNVs的工具，但从WGS数据中识别SNVs更为可靠。近年来，有多种工具或算法被报道用于从WGS数据中识别SNVs，例如CNVnator、VariationHunter、LUMPY、Tangram、scanITD和ITDetect。（Abyzov等人，2011；Hormozdiari等人，2010）
WES与WGS的比较
WES和WGS在基因组范围、技术性能和实际应用方面存在差异，这些差异直接影响了它们的临床用途（图4）。WES专注于蛋白质编码外显子及其相邻的剪接位点，通常以较低的成本实现高覆盖深度和更易于管理的数据量，使其成为许多疑似单基因疾病的有效初步检测方法，因为致病性变异通常位于编码区域。
NGS在癌症诊断和精准肿瘤学中的应用
目前，基于NGS的方法不仅在癌症的诊断和预后中发挥着关键作用，还在指导适当的治疗方案方面发挥作用。与单基因方法不同，NGS能够分析与癌症致病性相关的多个基因和区域。（Ghoreyshi等人，2025）
肿瘤突变负担（定义为癌症基因组中每兆碱基（Mb）的体细胞突变总数）被认为是免疫检查点反应的预测生物标志物
NIPT
在适当的时间使用WES或基于WES的方法可以增强对各种异常的遗传变异的检测。一项先前的研究表明，对超声检查可检测到异常的胎儿进行NGS检测时，45.9%的病例发现了遗传原因。（Huang等人，2023）此外，Wang等人（2023）结合了WES和染色体微阵列分析（CMA）来识别胎儿的遗传原因
遗传性眼病
遗传性眼病是导致视力障碍的主要原因，许多眼病与特定基因突变相关。Haer-Wigman等人（2017）在266名视力受损的荷兰人中使用了WES，约51%的病例发现了致病性变异。WES在诊断眼病方面的效果因疾病类型而异，其中视网膜营养不良（尤其是视网膜色素变性）的诊断成功率最高，达到63%
数据分析、人工智能和未来方向
WES和WGS产生的大量复杂数据需要先进的分析工具。读段比对方法、变异调用算法、注释工具和质量控制程序的选择决定了哪些遗传变异将报告给临床医生。人工智能和机器学习方法已成为变异选择、多组学数据整合、疾病预测和治疗反应预测的重要工具。
结论
作为高通量技术，基于NGS的方法能够检测基因组中的致病性变异。多项研究表明，这些方法可作为可靠的遗传疾病诊断工具。鉴于其高诊断效率，WES和WGS被强烈推荐作为一级或二级检测手段来识别遗传疾病。然而，使用基于NGS的技术（如WES）进行疾病诊断也存在一些挑战。
作者贡献声明
阿曼·莫拉迪（Arman Moradi）：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、项目管理、研究
米娜·穆萨维（Mina Mousavi）：初稿撰写
马吉德·马莱基（Majid Maleki）：审稿与编辑、监督、研究
赛义德·佐哈·塔巴塔巴埃（Seyedeh Zoha Tabatabaei）：审稿与编辑、资源协调、研究
马赫希德·马拉库蒂安（Mahshid Malakootian）：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、监督、研究、数据管理、概念构思
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
