《Advanced Science》：Hepatocyte BPGM Induces RET Lactylation and Macrophage Reprogramming to Promote Tumorigenesis in Hepatocellular Carcinoma
编辑推荐：
本文揭示了糖酵解关键酶BPGM在肝细胞癌（HCC）中的促癌新机制：BPGM通过促进P300介导的原癌基因RET第549位赖氨酸（K549）乳酸化修饰，竞争性抑制其泛素化降解，从而稳定RET蛋白表达，驱动HCC细胞增殖迁移；同时，BPGM介导的乳酸分泌增加肿瘤微环境中巨噬细胞的组蛋白乳酸化水平，诱导其M2极化，共同促进HCC进展。该研究为HCC提供了新的潜在治疗靶点。
BPGM在肝细胞癌组织中上调并与不良预后相关
研究团队通过生物信息学分析和临床样本验证发现，双磷酸甘油酸变位酶（BPGM）在肝细胞癌（HCC）组织中的mRNA和蛋白表达水平均显著高于癌旁组织。基于癌症基因组图谱（TCGA）数据库的分析表明，BPGM的高表达与HCC患者较低的组织学分级（G3/G4）、更晚的临床分期（III/IV）以及更短的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）显著相关。值得注意的是，BPGM在区分HCC组织与正常肝组织方面的诊断效能（AUC = 0.8517）显著优于甲胎蛋白（AFP）（AUC = 0.6160）。单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据进一步揭示，BPGM的表达上调主要发生在肿瘤组织中的恶性肝细胞。
敲除BPGM在体内抑制HCC肿瘤生长
为了在体内验证BPGM的功能，研究人员构建了肝细胞特异性Bpgm基因敲除（Bpgm-CKO）小鼠模型，并使用二乙基亚硝胺（DEN）诱导HCC发生。与对照组（Bpgm-CON）小鼠相比，Bpgm-CKO小鼠的肝脏肿瘤负荷显著减轻，表现为肝脏重量、最大肿瘤直径和肿瘤数量均明显减少。组织学分析显示，Bpgm-CKO小鼠肝脏的纤维化程度（α-SMA染色和天狼星红染色评估）和细胞增殖活性（Ki-67染色评估）也显著降低。这些结果证实了肝细胞特异性BPGM缺失能够有效减缓HCC的进展。
BPGM表达显著增强单核/巨噬细胞在HCC肿瘤微环境中的浸润
结合空间转录组学和单细胞RNA测序技术，研究人员绘制了HCC肿瘤微环境（TME）的空间细胞图谱。分析发现，在Bpgm-CON小鼠的肝细胞周围40微米区域内，单核/巨噬细胞是比例最高的免疫细胞群体。空间生态位分析进一步表明，在肝细胞富集的生态位中，Bpgm-CON小鼠的单核/巨噬细胞比例显著高于Bpgm-CKO小鼠。这一发现提示BPGM的表达促进了单核/巨噬细胞在HCC肿瘤微环境中的招募和聚集。
BPGM在单细胞水平诱导肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的M2极化
对小鼠HCC组织的scRNA-seq数据深入分析显示，Bpgm-CKO小鼠中恶性肝细胞和巨噬细胞的比例均有所下降。在恶性肝细胞中，Bpgm-CON小鼠的多个促增殖通路效应分子（如Myc、Met、Jun、Ccnd1、Fos、Axin2）表达更高。对巨噬细胞亚群进行重新聚类分析后，研究人员根据M2型巨噬细胞标志物Mrc1的表达，将巨噬细胞划分为M2型肿瘤相关巨噬细胞（M2 TAMs）和非M2 TAMs。结果发现，Bpgm-CON小鼠中M2 TAMs的比例以及M2 TAMs中Mrc1的表达水平均显著高于Bpgm-CKO小鼠。免疫荧光染色结果也证实，Bpgm-CON小鼠肝组织中CD68+CD206+的M2型巨噬细胞数量更多。这些结果表明，BPGM驱动了恶性肝细胞的活化与M2型TAMs的扩增。
BPGM促进HCC细胞的体外增殖和迁移
在Huh7和PLC/PRF/5两种HCC细胞系中过表达BPGM，能显著增强细胞的增殖能力（CCK-8实验和克隆形成实验）和迁移能力（划痕实验和Transwell实验）。相反，利用小干扰RNA（siRNA）敲低BPGM的表达，则能有效抑制HCC细胞的这些恶性表型。这些体外实验直接证明了BPGM对HCC细胞增殖和迁移的促进作用。
BPGM与HCC细胞中乳酸生成和蛋白质乳酸化正相关
基因集富集分析（GSEA）显示，在Bpgm-CON小鼠的恶性肝细胞中，乳酸代谢和乳酸化相关基因集显著富集。具体而言，乳酸相关基因（Ldha、Pkm、Hif1α）和乳酸化相关基因（Ep300、Aars1、Hk2）的表达水平更高。TCGA数据库分析也表明，BPGM高表达的HCC患者中，乳酸相关信号通路被激活。体外实验证实，过表达BPGM的PLC/PRF/5细胞内乳酸浓度和整体蛋白质乳酸化（Pan-Kla）水平均升高。此外，BPGM的表达与组蛋白乙酰转移酶P300（EP300）的mRNA水平呈正相关。这些数据将BPGM与HCC细胞的乳酸生成和蛋白质乳酸化修饰紧密联系起来。
BPGM调控HCC细胞中RET-K549的乳酸化和泛素化
为了寻找BPGM介导的乳酸化修饰的下游靶蛋白，研究人员采用了免疫共沉淀联合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析技术。在过表达BPGM的HCC细胞中，原癌基因RET被鉴定为一个关键的差异乳酸化蛋白。后续的免疫共沉淀（Co-IP）实验验证了BPGM能够促进RET蛋白的乳酸化修饰，并导致RET蛋白表达水平上调。Bpgm-CKO小鼠肝组织中的RET蛋白表达也相应降低。生物信息学预测发现RET蛋白的K523、K549和K965位点同时是潜在的乳酸化和泛素化修饰位点。通过点突变实验证实，K549位点的突变（K549R）能同时消除RET的乳酸化和泛素化修饰，而K523R和K965R突变则无此效应。使用葡萄糖抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）降低细胞内乳酸水平后，RET的乳酸化修饰减少，同时泛素化修饰增加。进一步研究发现，敲低P300的表达会降低整体蛋白质乳酸化水平，并导致RET的泛素化修饰增强。这些结果揭示了一个新颖的机制：BPGM通过促进P300介导的RET蛋白K549位点的乳酸化修饰，竞争性地抑制了该位点的泛素化修饰，从而减少了RET蛋白的降解，增强了其稳定性。
RET介导BPGM诱导的HCC细胞增殖和迁移
功能回复实验表明，在过表达BPGM的PLC/PRF/5细胞中敲低RET，能够显著减弱BPGM对细胞增殖和迁移的促进作用。反之，在敲低BPGM的细胞中过表达RET，则可以恢复细胞的增殖和迁移能力。这证明RET是BPGM发挥促癌功能的下游关键效应分子。
HCC细胞中的BPGM促进巨噬细胞的M2极化
研究人员进一步探讨了BPGM对肿瘤微环境中巨噬细胞的影响。发现过表达BPGM的HCC细胞培养上清液中的乳酸浓度显著升高。用此条件培养基处理由THP-1细胞经PMA诱导分化的M0巨噬细胞后，发现巨噬细胞内组蛋白乳酸化水平升高，M2型巨噬细胞标志物（MRC1、IL10、ARG1、CD163）的mRNA和蛋白（CD206）表达上调，流式细胞术检测到的CD68+CD206+M2巨噬细胞比例也增加。生物信息学分析显示，在TCGA的HCC数据中，BPGM表达与M2巨噬细胞浸润呈正相关。当使用 monocarboxylate transporter (MCT) 特异性抑制剂Alpha-cyano-4-hydroxycinnamate (CHC) 阻断乳酸转运后，由BPGM过表达细胞上清液诱导的M2极化效应被显著削弱。这表明BPGM通过分泌乳酸，以MCT依赖的方式促进了肿瘤微环境中巨噬细胞向M2表型的极化。
讨论与结论
本研究系统性地阐明了糖酵解酶BPGM在HCC进展中的新型致癌功能。其核心机制是双重的：在肿瘤细胞内部，BPGM通过增加乳酸生成，促进P300介导的RET原癌蛋白K549位点的乳酸化修饰，该修饰竞争性抑制了RET的泛素化降解途径，从而稳定并增加了RET蛋白的表达，进而驱动HCC细胞的增殖和迁移；在肿瘤微环境中，BPGM介导的乳酸分泌增加了肿瘤相关巨噬细胞内的组蛋白乳酸化水平，诱导其向促进肿瘤的M2表型极化。这两条通路共同促进了HCC的肿瘤发生。该研究不仅深化了对HCC代谢 reprogramming 和肿瘤微环境相互作用的理解，也为将BPGM作为HCC诊断生物标志物和潜在治疗靶点提供了坚实的科学依据。
