《ChemBioChem》：Selection and Characterization of SARS-CoV-2 Spike Binding Clickmers
编辑推荐：
本文报道了利用点击化学系统进化配体（click-SELEX）技术成功筛选出靶向SARS-CoV-2刺突（CoV2-S）糖蛋白的化学修饰DNA适配体（称为clickmer）。研究通过两种独立的“拆分-合并”筛选策略，获得了分别功能化有苯并呋喃（BF-dU）或吲哚（In-dU）基团的clickmer家族。先导候选分子BF1和N2对野生型CoV2-S具有纳摩尔级亲和力，并能结合包括Alpha、Delta和Mu在内的多种变异株。通过截短优化获得的31个核苷酸clickmer T2，对Omicron变异株显示出增强的结合能力。该工作凸显了click-SELEX平台在开发针对临床相关靶标的高亲和力、高特异性分子识别工具方面的巨大潜力和应用价值。
引言
高亲和力分子识别元件的持续开发是生物技术、诊断学和治疗设计领域的基石。自COVID-19大流行以来，已有大量靶向SARS-CoV-2刺突（CoV2-S）糖蛋白的核酸适配体被报道，包括基于DNA和RNA的序列。然而，它们的相互作用特性受限于经典核苷酸有限的化学多样性。
为了扩展刺突蛋白结合寡核苷酸的化学库，本研究聚焦于称为clickmer的化学多样化适配体。这些合成适配体用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）替代胸苷，提供了一个末端炔烃手柄，可通过铜(I)催化的叠氮-炔环加成（CuAAC）进行正交修饰。这种策略能够将多种功能部分（称为“click-in”）位点选择性地缀合到核酸骨架上，显著扩展了适配体支架可及的化学和功能景观。
Clickmer是通过一种称为click-SELEX的适应性体外选择过程产生的，这是成熟的指数富集配体系统进化（SELEX）方案的改良形式。在click-SELEX中，掺入EdU残基的寡核苷酸库通过CuAAC点击化学进行化学多样化，从而能够进化出对复杂靶标（如病毒糖蛋白）具有增强结合亲和力、稳定性和选择性的配体。
本研究报道了结合CoV2-S糖蛋白的clickmer的选择和生化表征，证明了具有诊断潜力的高亲和力、化学多样化clickmer的成功富集。在筛选出的候选物中，我们鉴定了一个特别有效的结合剂，并通过合理的截短进一步优化了其与Omicron变异株的结合能力。由此产生的最小clickmer T2，尽管序列长度缩短，仍保留了高亲和力结合。重要的是，与先前开发的未修饰DNA适配体相比，T2也能结合CoV2-S Omicron变异株，这凸显了基于clickmer的识别即使在高度突变的刺突蛋白变异株背景下的稳健性。这些发现强调了click-SELEX平台的多功能性和clickmer作为病毒检测及其他领域的适应性分子工具的实用性。
结果
CoV2-S结合Clickmer的选择与表征
为了鉴定结合CoV2-S（即在哺乳动物细胞中表达、稳定在预融合构象的三聚化His标签标记的CoV2-S胞外域）的clickmer，我们进行了两个独立的拆分-合并点击选择（SELEX A和SELEX B），它们在所使用的化学实体集合和孵育步骤的条件上有所不同。SELEX A旨在模拟唾液条件，以期进化出适用于诊断目的的clickmer。SELEX B在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中进行，旨在选择用于治疗目的的适配体。
经过10轮（SELEX A）或8轮（SELEX B）具有递增严格度的选择后，通过流式细胞术评估富集的DNA库的结合情况。结果表明，只有在用苯并呋喃（BF-dU，SELEX A）或吲哚（In-dU，SELEX B）进行点击修饰时，富集的DNA库才显示出与CoV2-S的结合增加。未修饰的DNA或用选择过程中使用的任何其他残基点击的DNA均未检测到相互作用。
通过下一代测序（NGS）分析DNA种群，并选择代表性序列BF1、BF2、BF3（来自SELEX A）和N1-N9（来自SELEX B）进行进一步表征。所有测试的序列在以BF-dU（SELEX A候选物）或In-dU（SELEX B候选物）修饰时均显示与CoV2-S的结合，而未点击或以其他化学实体修饰时则不结合。浓度依赖性结合分析显示，BF-dU修饰的BF1和BF3的平衡解离常数（KD）分别为87 nM和69 nM。对于SELEX B候选物，在浓度高达500 nM时未观察到信号强度饱和。相应的打乱序列对照未显示结合。
对BF1和N2进行了EdU位点重要性评估。通过合成一系列点突变体（将单个EdU残基替换为胸苷），确定了BF1中8个EdU位点中的5个（位置44、45、48、51、53）和N2中7个EdU位点中的5个（位置48、50、52、55、56）对于CoV2-S结合至关重要。基于这些结果，选择了保留必要点击位点的优化变体BF1.5和N2.5用于后续研究。
N2和BF1.5与CoV2-S变异株的结合表征
接下来检查了刺突蛋白突变对两种clickmer结合能力的影响。使用表达Alpha（B.1.1.7）或Beta（B.1.315）刺突变异株的Flp-In T-REx细胞进行的基于流式细胞术的结合实验表明，N2 clickmer仅与Alpha变异株特异性结合，而未能与Beta变异株相互作用。BF1.5也显示出与表达Alpha变异株细胞的结合，与N2相反，BF1.5表现出与Beta变异株的中等程度结合。在缺乏刺突蛋白表达的情况下，仅观察到最小的细胞表面结合，证实了所鉴定clickmer具有相关的靶标特异性。
通过表面等离子共振（SPR）测量确定了两种clickmer与CoV2-S变异株的结合亲和力。将生物素化的clickmer固定在链霉亲和素（SA）传感器芯片上，滴定不同浓度的刺突蛋白，得出BF1.5与野生型刺突蛋白的KD为27.8 nM，N2为40.7 nM。将SPR分析扩展到评估BF1.5和N2与Delta（B.1.617.2）和Mu（B.1.621）变异株的结合亲和力。两种clickmer都与这两种变异株发生相互作用，并且有趣的是，与野生型相比，对这些刺突变异株表现出改善的亲和力。
为了验证SPR获得的亲和力常数，我们采用微尺度热泳（MST）作为另一种技术来评估Cy5标记的N2与野生型和Delta CoV2-S的结合。其变体N2.5也针对Delta CoV2-S进行了测试，以确认去除两个非必需EdU残基确实对结合亲和力没有显著影响。MST测量结果与SPR数据一致。
N2的截短揭示了与Omicron CoV2-S变异株结合增强的31个核苷酸Clickmer
接下来测试了clickmer与Omicron CoV2-S变异株（B.1.1.529）的结合能力。最初的流式细胞术实验显示，N2的结合显著降低，而BF1.5则完全丧失亲和力。同时，我们观察到非结合点击对照与此变异株的非特异性相互作用增加。
为了提高特异性并可能增强对Omicron刺突蛋白的可及性，基于N2.5预测的二级结构（使用NUPACK），合理设计了几种N2.5的截短变体。预测的结构表明了一个包含凸起和发夹环的结构化区域，该区域带有共同的基序。因此，我们生成了T1（47 nt）、T2（31 nt）和T3（18 nt）的N2.5截短体，它们显示出与N2.5完全或部分的结构相似性。我们还通过去除两个20 nt长的引物结合区（PBS）生成了另一个截短体T4，预计该截短体会部分丧失这一重要的结构元件。
使用流式细胞术，我们初步评估了每个截短变体与三聚体Delta刺突蛋白的结合。所有三个变体（T1, T2, T3）都保留了结合活性，其中T2与全长N2.5相比表现出显著的结合增加。T4截短体显示出结合强度较N2.5降低，这与预测的原始二级结构破坏一致。
接下来，我们比较了T2与Omicron刺突蛋白的结合与N2.5的结合。作为非结合对照，生成了T2的打乱版本，称为T2sc，并使用未修饰的T2来研究其点击依赖性。如图所示，只有在吲哚功能化时，T2 clickmer截短体的性能基于测量的平均荧光强度（MFI）优于N2.5。通过计算与其打乱非结合对照相比的荧光倍数变化，T2显示增加了16倍，而N2.5显示了2.3倍的增加。
为了进一步评估T2变体与Omicron刺突蛋白的结合亲和力，我们进行了生物层干涉术（BLI）分析。将生物素化的T2固定在SA传感器上，并暴露于三聚体Omicron刺突蛋白的系列稀释液中。产生的传感图得出的解离常数（KD）为1.3 nM，表明T2与Omicron刺突之间存在高亲和力相互作用，这与流式细胞术中观察到的增强结合强度一致。为了评估特异性，T2也针对重组神经氨酸酶进行了测试。对神经氨酸酶获得的响应明显低于对Omicron刺突的响应，证实了T2对刺突蛋白的选择性识别。正如预期，打乱对照T2sc在所有测试蛋白中均表现出可忽略的结合。
结论
本研究旨在阐明在两种不同生理条件下鉴定结合CoV2-S蛋白的不同clickmer。采用了拆分-合并点击-SELEX方案，涉及同时使用多种修饰。根据以往的研究，后续分析显示，所得的clickmer在点击-SELEX过程中使用的实体（即苯并呋喃（BF-dU）或吲哚（In-dU））中表现出点击特异性结合CoV2-S的亲和力。与密切相关的官能团（例如苯并噻吩（BT-dU））的相互作用分析显示了变异潜力，为改变clickmer的特性提供了选项。
这些clickmer在结合CoV2-S变异株（包括Beta、Delta和Omicron）的特异性方面显示出差异。这些差异可能归因于富集过程中使用的个体点击部分或所应用的不同选择条件。胸苷核苷酸替换研究表明，需要八个（clickmer BF1）或七个（clickmer N2）修饰中的至少五个才能保持与刺突蛋白的相互作用。
我们还证明了clickmer N2的截短产生了变体T2（31 nt）。与原始clickmer（82 nt）相比，该变体对CoV2-S变异株表现出更强的结合亲和力。这一发现表明，原始clickmer序列的空间位阻，或者与截短版本相比，全长版本中采用具有不同相互作用特性的替代构象，可能是观察到的结合行为的基础。
与最近的进展（如MEDUSA平台，该平台证明含有化学修饰核苷酸的多价适配体组装体可以利用靶标几何结构和价态来实现增强的亲和力和选择性）一致，我们的发现进一步强调了化学修饰在微调结合特异性和性能方面的潜力。所描述的clickmer代表了用于诊断开发和潜在治疗探索的有希望的候选物。这项工作突出了点击-SELEX方法的适应性，特别是在需要快速响应的紧急情况下，并说明了其提供敏感检测探针以用于即时大流行或病毒爆发控制的潜力。
