《The FEBS Journal》：Targeting the microbiota-miRNA-protease axis: A new therapeutic avenue in melanoma
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本综述深入探讨了微生物群-miRNA-蛋白酶轴在黑色素瘤中的关键作用，重点阐述了microRNA（miRNA）如何通过靶向细胞外基质（ECM）蛋白酶（如MMPs、ADAMs等）调控肿瘤微环境（TME），并详细分析了肠道微生物群通过代谢产物（如短链脂肪酸SCFAs）及免疫调节影响miRNA表达，进而影响黑色素瘤进展及免疫检查点抑制剂（ICI）疗效的机制。文章系统梳理了直接靶向蛋白酶或参与相关通路（如NF-κB）的miRNA（如miR-146a-5p, miR-34a, miR-21, miR-155等）的功能，评估了基于miRNA（如模拟物、抑制剂）和微生物群（如益生菌、代谢物）的治疗策略潜力，为克服当前治疗耐药性、开发新型辅助疗法提供了创新视角。
摘要
细胞外基质（ECM）重塑是黑色素瘤转移发生的关键前提过程。ECM蛋白酶参与ECM转换过程中基质成分的降解，这与黑色素瘤细胞的生长、迁移、侵袭、外渗、转移以及黑色素瘤肿瘤免疫原性的调节相关。在此过程中，ECM蛋白酶活性和浓度的波动响应于在蛋白酶基因表达的转录和转录后水平起作用的复杂调控机制。本综述探讨了表观遗传机制的主要因素，特别是蛋白酶调控微小RNA（miRNA），涉及其直接靶向ECM蛋白酶转录本并影响黑色素瘤进展的能力。此外，鉴于肠道微生物群失调已被确定为黑色素瘤对当代免疫疗法产生耐药的病因学因素，本综述考察了将肠道菌群失调诱导的靶向基质金属蛋白酶的miRNA谱变化与黑色素瘤进展联系起来的证据。最后，我们评估了涉及肠道微生物群种群修饰以及直接靶向ECM蛋白酶的miRNA的治疗潜力。这些策略的整合可能有助于开发创新的辅助疗法，旨在克服当前抑制剂检查点免疫疗法的耐药性。
miRNA对ECM蛋白酶的靶向调控
蛋白酶在黑色素瘤部位通过三种主要机制促进黑色素瘤进展。除了通过Notch激活对细胞增殖产生直接效应外，它们还通过催化血管生成分子（如内皮抑素和肿瘤抑素）的形成来促进血管生成。它们还在癌细胞迁移和侵袭过程中参与ECM的切割，并通过切割和释放ECM结合的细胞因子和生长因子来进一步影响进展，这些因子支持肿瘤细胞增殖并吸引相关的免疫细胞和成纤维细胞。在MMP家族中，某些成员如MMP-8、MMP-9和MMP-12已被报道具有肿瘤抑制功能，而大多数其他成员则与黑色素瘤进展相关。
当前知识表明，MMP在黑色素瘤中的表达和功能与肿瘤生长阶段密切相关。黑色素瘤的每个阶段都以MMP水平的增加或减少为特征，这相应地促进胶原降解以支持侵袭，或促进胶原沉积以增强生长信号。此外，其他蛋白酶，如ADAMTS-5，已被报道具有与黑色素瘤抑制相关的效应。在此背景下，直接靶向MMPs的miRNA在塑造基质动力学方面起着至关重要的作用。直接靶向肿瘤抑制性MMPs的miRNA可以增强致癌MMP活性，导致侵袭和转移增加。一项最近使用13个黑色素瘤细胞系的研究确定了miR-17-5p、miR-22-3p、miR-181a-5p、miR-20a-5p、miR-218-5p、miR-24-3p、miR-26a-5p和miR-145-5p作为MMP-7、MMP-11和MMP-14表达的关键调控因子。此外，已证实miR-296-3p在黑色素瘤细胞和组织中直接靶向MMP-2和MMP-9。在黑色素瘤小鼠模型中，已知let-7b靶向basigin，这是整体MMP合成的上游调控因子。此外，在黑色素瘤中具有肿瘤抑制作用的miR-34a-5p可在膀胱癌细胞中直接抑制MMP-2表达。miR-143已被证明可在黑色素瘤细胞中抑制与迁移相关的MMP-9水平，这是通过蛋白质水平分析证实的，而非通常用于证明直接RNA-RNA相互作用的常规方法。相反，miR-143在其他恶性肿瘤中直接靶向MMP-13。而且，miR-27b-3p早已被确定为鳞状细胞癌（SCC）中MMP-13的调控因子；这一观察可能具有相关性，因为该miRNA通过靶向Myc在黑色素瘤中作为有效的肿瘤抑制因子发挥作用。
蛋白酶活性的额外间接调控由miRNA通过调节编码内源性蛋白酶抑制剂的转录本来实现，这些抑制剂包括组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）、血小板反应蛋白（TSPs）和细胞表面蛋白RECK。这些抑制剂在黑色素瘤细胞和患者来源的黑色素瘤组织中经常失调且通常低表达。例如，miR-182在黑色素瘤细胞中靶向RECK，导致增殖率增强，而miR-21直接靶向TIMP3，从而促进黑色素瘤细胞侵袭和转移。相反，TSP-1被认为是黑色素瘤中的转移促进因子，并受到miR-30c-1*和miR-193b的直接靶向，这已被证明可降低黑色素瘤细胞的体外侵袭。
类似于肿瘤促进性MMPs，ADAM-9、-10、-17和-19已被确定为黑色素瘤细胞增殖和进展的贡献者。miR-126/126*已被证明在黑色素瘤细胞中靶向ADAM-9和MMP-9，起到肿瘤抑制因子的作用。此外，最近的研究结果表明，miR-150-5p直接靶向ADAM-19转录本，导致黑色素瘤细胞增殖减少，而通过miR-526-5p介导的ADAM-15靶向也观察到类似的结果。一些miRNA也被报道在其他病理条件下靶向各种ADAMTS亚型；然而，目前尚无关于miRNA在黑色素瘤中直接靶向ADAMTS的报告。类似地，没有关于miRNA在黑色素瘤中直接靶向uPA的数据。然而，鉴于uPA在黑色素瘤中的作用包括ECM降解以及通过与细胞表面受体uPAR相互作用激活致癌信号，值得注意的是uPAR可以被miR-378a-5p正向调控以促进黑色素瘤进展。此外，巨噬细胞来源的外泌体miR-29c-3p已显示通过直接抑制上游uPA调控因子ENPP2（autotaxin）来抑制黑色素瘤细胞中的uPA表达。
miRNA–微生物组轴
研究表明，黑色素瘤表面的皮肤微生物群可以促进黑色素瘤细胞侵袭，而肠道微生物群的破坏日益被认为与胃癌、结直肠癌和黑色素瘤肿瘤的发生和进展直接相关。肠道真菌和细菌种群的改变已被证明可促进黑色素瘤的早期侵袭性。菌群失调驱动的致癌作用涉及多种机制，包括毒力因子的分泌和治疗药物的代谢，这些共同影响免疫反应和治疗方式的疗效。大量注意力集中在理解肠道共生菌如何影响对免疫检查点抑制剂（ICI）疗法的反应，特别是那些靶向PD-1/PD-L1的疗法。最近的孟德尔随机化研究确定了特定微生物物种（如Bacteroidia sp.和Veillonella sp.）对黑色素瘤的保护作用。此外，长双歧杆菌、屎肠球菌和嗜气柯林斯菌已被证明可增强PD-1抑制剂治疗的有效性，Parabacteroides家族的成员也可能具有这种潜力。然而，Parabacteroides和Bacteroides的存在不应被视为普遍有益，因为它们还进一步与结肠癌、乳腺癌和肝癌的发展有关。类似地，棒状杆菌和Blautia sp.的某些益生菌菌株与转移性黑色素瘤进展呈正相关。
饮食是影响定植于肠道的微生物群种群的关键因素；某些纤维支持的益生菌菌株已被观察到通过调节黑色素瘤患者免疫疗法的有效性来影响黑色素瘤进展。给定益生菌菌株对黑色素瘤进展的影响似乎取决于其分泌介质的类型和效应。例如，据报道，罗伊氏乳杆菌通过涉及分泌吲哚-3-醛（I3A）的机制改善黑色素瘤患者的总生存期并减小肿瘤大小，而金黄色葡萄球菌磷脂酶C（PLC）与黑色素瘤细胞侵袭潜力增加有关。各种微生物产物——如鞭毛蛋白、肠毒素B（SEB）、色氨酸代谢物、脂多糖（LPS）、脱氧胆酸（DCA）、乳酸、丙酸盐和丁酸盐——已被证明在实验环境中可抑制黑色素瘤的侵袭性和/或增强免疫疗法疗效。此外，从产生短链脂肪酸（SCFA）的物种向促炎物种的肠道微生物群转变与较差的预后和ICI疗法有效性降低相关。关于真菌微生物群，最近的研究表明，念珠菌 dominance在黑色素瘤患者的肠道微生物群中更为普遍，而先前的研究发现，黑色素瘤细胞暴露于白色念珠菌可促进黑色素瘤侵袭性和肝转移。已确定的一些机制涉及炎症（IL-18介导的）、促血管生成（VEGF介导的）和缺氧（HIF-1α介导的）信号通路的激活。
微生物存在和分泌因子对黑色素瘤相关MMP靶向miRNA的影响
目前，详细描述黑色素瘤细胞在暴露于微生物代谢物或分泌毒力因子（毒素）后miRNA表达和功能性miRNA靶向反应的研究有限，因此难以就ECM蛋白酶的间接调控机制得出结论。在非黑色素瘤模型中进行的一些研究可能为了解miRNA诱导的蛋白酶调控的间接机制提供见解。例如，在来自特应性皮炎患者的角质形成细胞以及特应性皮炎小鼠模型中，观察到金黄色葡萄球菌诱导MMP-1、MMP-3和MMP-9的表达，这伴随着miR-939的上调。这种对miR-939的反应可能是由于直接靶向TIMP2转录本。此外，金黄色葡萄球菌SEB已被证明在皮肤T细胞淋巴瘤和T细胞中诱导miR-155，同时它也可以直接靶向MMP-16。miR-155和miR-939都与黑色素瘤进展和对ICI的反应相关。需要进一步研究以确定这些miRNA是否能在SEB处理后于黑色素瘤细胞中表达，以及它们是否随后影响MMP表达。
短链脂肪酸（SCFAs）已被观察到抑制NF-κB活化，从而可能减少下游MMP表达。在化学诱导的皮肤癌小鼠模型中，发现丁酸盐上调miR-211和let-7a，有效限制MMP-9表达。此外，丁酸盐已被证明通过诱导miR-22在肝癌细胞中诱导细胞凋亡，这是在黑色素瘤中已明确的肿瘤抑制因子，直接靶向MMP-14，以及MMP-2和MMP-9。犬尿氨酸是一种色氨酸代谢物，限制黑色素瘤细胞增殖，但也通过其免疫抑制特性促进黑色素瘤转移，并已被证明在乳腺癌细胞中抑制miR-30b。虽然各种miR-30家族成员对黑色素瘤转移发挥不同的、成员特异性的作用，但所有成员似乎都直接或间接地调节MMP表达水平。因此，未来研究犬尿氨酸对黑色素瘤细胞中miR-30成员的影响将具有重要意义。此外，特定的微生物群能够诱导黑色素瘤细胞中的circ_0000730，从而抑制转移。值得注意的是，circ_0000730可以与其他类型的癌症中的miR-942相互作用并吸附它；已知miR-942可上调MMP-9合成并与黑色素瘤进展有关。考虑到所有这些证据，以及肠道微生物群影响黑色素瘤患者对ICI的反应，以及炎症性肠病和溃疡性结肠炎与黑色素瘤风险增加相关，我们可以推测粪便miRNA也可以通过调节肠道免疫反应来驱动黑色素瘤进展（在菌群失调的情况下呈正向）。支持这一理论的是，最近的研究将粪便let-7b和miR-21与肠道微生物群组成改变以及慢性肠道炎症联系起来，而有趣的是，在黑色素瘤患者血浆中升高的miR-21是已知通过激活黑色素瘤细胞内的NF-κB通路驱动黑色素瘤扩张的因子。重要的是，miR-21介导的基因表达调控不仅限于宿主细胞，还可以直接影响微生物群种群，促进编码上述部分分泌因子的转录本的表达。
因此，肠道微生物群影响黑色素瘤进展主要有两种机制：一种涉及分泌因子，可以刺激黑色素瘤和/或TME细胞中的特定miRNA表达（包括miRNA海绵）模式；另一种涉及粪便miRNA对胃肠道免疫细胞的直接效应，具有在肠道屏障破坏后调节全身炎症的潜力。此外，ECM成分，特别是MMPs的调控，是肠道和皮肤微生物群可能影响黑色素瘤进展和组织侵袭的过程。这已在与两个因素相关的讨论中得到阐述：微生物来源的分泌产物以及由致病微生物菌株启动的局部和全身炎症反应。
基于miRNA和基质生物组的疗法
黑色素瘤的基于miRNA的疗法面临若干挑战，主要由于miRNA稳定性和递送固有的局限性，例如稳定性受限、潜在的脱靶毒性以及先天免疫反应的激活。努力集中在增强结构稳定性——例如通过合成miRNA——以及改进靶向递送。纳米颗粒和病毒载体作为传统非选择性脂质载体（例如lipofectamine）的替代品已显示出前景，超声技术可能有助于将注射的miRNA引导至特定部位。值得注意的是，针对黑色素瘤TME内免疫逃避机制的miRNA给药，以及克服耐药性（BRAFi/MEKi）和与促炎介质产生相关的持续性NF-κB激活，已报道了令人鼓舞的结果。已证实强制表达miR-146a-5p可抑制黑色素瘤细胞和组织中的NF-κB活性，并且预计——尽管尚未检验——这也可能降低各种MMP家族成员的水平或活性。当前的讨论有助于不断增加可用于黑色素瘤患者给药的潜在治疗性miRNA列表，特别是那些直接靶向ECM蛋白酶的miRNA。如此处所述，选择特定的miRNA可以实现在避免受广泛NF-κB抑制策略潜在影响的肿瘤抑制性蛋白酶的同时，选择性靶向蛋白酶。
当前的黑色素瘤治疗策略已被发现会影响血浆和黑色素瘤组织中各种miRNA的水平，而miRNA本身也可以作为治疗剂。在此背景下，我们整理了受当前治疗方案影响或可用于治疗的所有MMP调控miRNA。例如，miR-134是一个MMP调控miRNA和免疫交叉的案例；它在黑色素瘤中间接调节MMP-2和MMP-9表达。坏死小鼠黑色素瘤异种移植瘤的高强度聚焦超声技术降低了miR-134水平和相关转移，同时通过增加IFN-γ和TNF-α分泌支持共培养脾淋巴细胞的免疫反应。类似地，已经对ICI诱导的miRNA变化进行了综述，强调了此处显示的靶向或调节MMPs的miRNA。其中，miR-155、miR-125b、miR-20a、miR-532-5p、miR-106b和miR-222被确定为MMP表达的调控因子，它们的水平随着ICI反应而增加。据报道，miR-20a通过预测靶向MMP-2抑制黑色素瘤侵袭性，并且已显示miR-125b在CSCC中直接靶向MMP-13，限制增殖、迁移和侵袭。miR-532-5p和miR-106b在接受ICI治疗的黑色素瘤患者中血清水平降低，也已在别处被描述为分别靶向MMP-13和MMP-2。此外，在用抗CTLA-4抗体ipilimumab治疗的黑色素瘤患者的肿瘤组织中，miR-222水平似乎增加，与较高的临床获益相关，可能是由于其MMP-1靶向特性。最近关于接受ICI患者黑色素瘤组织中B细胞特异性外泌体miRNA的非同行评审研究表明，B细胞衍生的miR-99a可能增强适应性免疫介导的肿瘤抑制并改善对ICI治疗的反应。值得注意的是，已发现miR-99a在其他癌症类型中负调控几种MMP，包括MMP-2、MMP-9、MMP-7和MMP-13。
相反，miR-146a、miR-155和miR-21在调节MMP活性中表现出复杂的作用，例证了细胞特异性表达如何可变地影响ICI疗法的疗效。尽管如前所述，miR-146a可以抑制黑色素瘤细胞中的NF-κB信号传导，但它在TME内T细胞中的存在与IFN-γ产生减少和促炎反应减弱相关。然而，这种不利效应被miR-146a介导的黑色素瘤细胞内PD-L1表达降低所减轻，从而可能增强ICI反应性。此外，虽然miR-155在肿瘤细胞中表达时促进黑色素瘤进展——通过CAFs支持MMP-9驱动的迁移和侵袭——但它在CD8+ T细胞中的表达与改善的ICI结果和总生存期相关，而在调节性T细胞（T-regs）中的有限表达与较差的预后相关。此外，miR-155可以结合MMP-16的3'-UTR，并且相互矛盾的报告表明，黑色素瘤组织中该miRNA的上调可能抑制患者中的黑色素瘤生长。相比之下，如前所述，miR-21在黑色素瘤组织中作为肿瘤抑制因子，但在巨噬细胞中表达时与对PD-1免疫疗法的反应性降低相关。这一观察结果是出乎意料的，因为miR-21靶向STAT3并抑制巨噬细胞向M2休眠表型转变，从而支持局部TME中的促炎环境。虽然miR-155和miR-21作为黑色素瘤进展和ICI反应的关键调控因子吸引了相当大的研究兴趣，但它们组织特异性表达模式固有的复杂性目前限制了它们作为治疗生物标志物或靶点的开发。
利用组织特异性递送miRNA、抗miRNA或合成miRNA的治疗方法已在黑色素瘤模型中进行了评估，并展示了令人鼓舞的结果。尽管这些给药的miRNA最初并非设计用于特异性调节ECM蛋白酶水平，但它们广泛的靶标范围——可能也包括MMP转录本——可能部分解释了观察到的对抗黑色素瘤进展的功效，特别是在体内环境中。例如，在小鼠异种移植黑色素瘤模型中给药合成核糖核酸酶抗性miR-205（一种可能通过调节MMP清除受体间接影响MMP-2/9表达和活性的miRNA）导致肿瘤负荷显著减少。类似地，用靶向MMP-2的miR-34a治疗在B16F10小鼠黑色素瘤模型中有效限制了肺转移。此外，至少两种MMP调控miRNA（miR-34a和miR-182）的联合给药已被证明可使黑色素瘤细胞对化疗药物敏感。相应地，全身给药miR-21增加了黑色素瘤异种移植模型中对ICI的反应性。然而，评估miR-34a及其模拟物的临床试验由于不良免疫反应已被中止，这可能是由于非选择性递送至肿瘤部位以外的区域所致。这些发现强调了开发具有增强组织特异性的先进miRNA递送系统的关键需求。
几个研究小组已经检查了与黑色素瘤进展相关的circRNA和长链非编码RNA（lncRNA）作为潜在的黑色素瘤生物标志物。CircRNA可以以类似于miRNA的方式递送，包括通过外泌体或纳米颗粒，最近的综述已经讨论了基于circRNA的疗法。尽管过去4年有数据可用，但尚未找到关于黑色素瘤标本中微生物群诱导的circRNA的信息。考虑到circRNA在各种癌症中ICI耐药的作用，需要进一步研究以确定那些综述中强调的circRNA表达是否可能受肠道和皮肤微生物群共生菌的影响，识别它们的miRNA靶标，并评估对蛋白酶转录本调控的任何影响。结合miRNA和circRNA的研究可能提供新的见解，并且对circRNA-miRNA-基质生物组相互作用的更好理解可以为选择益生菌菌株用作当前ICI治疗的辅助疗法提供信息。基于现有文献，已鉴定出可以吸附miR-134的circ_0084043影响黑色素瘤转移并可能影响PD-1免疫治疗结果。相反，KCNQ1OT1是一种吸附黑色素瘤抑制因子miR-34a的lncRNA，导致黑色素瘤细胞中STAT3介导的PD-L1表达增加，并可能影响PD-1免疫治疗的疗效。
另一种方法涉及肠道和皮肤微生物群以及局部TME的靶向调控。在皮肤方面，证据突出了黑色素瘤和微生物抗原之间的交叉反应性，表明实验策略如用表达这些抗原的细菌感染黑色素瘤组织值得研究。此外，可以通过膳食纤维和益生元补充、施用特定益生菌菌株或使用已知调节肠道共生种群
