《Scientific Reports》：A standardized approach for the isolation of vascular smooth muscle cells from carotid atherosclerotic plaques
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本研究针对颈动脉粥样硬化研究中血管平滑肌细胞(VSMC)分离存活率低的技术瓶颈，开发了优化的酶消化法。通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)验证，该方法成功获得高活性VSMC，并揭示其从收缩型经泡沫细胞样/炎性合成状态向成纤维细胞样表型转换的动态轨迹，为探究斑块不稳定性机制提供了关键技术平台。
在脑血管疾病研究领域，颈动脉粥样硬化始终是导致心脑血管事件的重要病理基础。特别是发生在颈内动脉的不稳定斑块，因其易破裂特性而成为缺血性卒中的主要诱因。斑块内部的细胞动态，尤其是血管平滑肌细胞(VSMC)的生物学行为，在动脉粥样硬化发生发展中扮演着关键角色。这些细胞不仅参与斑块纤维帽的形成与维持，更在病理刺激下发生深刻的表型转换，从分化的收缩状态转变为合成、炎症甚至巨噬细胞样状态，直接影响斑块的稳定性。
然而，深入研究VSMC在动脉粥样硬化中的作用面临重大技术挑战。人体动脉粥样硬化斑块组织具有高度异质性，包含大量钙化区域、脂质核心和纤维化组织，使得从中高效分离具有活性的VSMC变得异常困难。传统分离方法往往获得细胞数量有限、存活率低，难以满足现代细胞生物学研究，特别是单细胞分析的技术要求。这一技术瓶颈严重制约了科研人员对VSMC在动脉粥样硬化中生物学行为的深入理解。
为了突破这一限制，由麦吉尔大学健康中心研究所血管健康单元的Jae Hyun Byun、Stella S. Daskalopoulou等研究人员组成的团队，在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们开发并优化了一套从人颈动脉粥样硬化斑块中分离VSMC的标准化流程，并通过单细胞转录组学技术全面验证了分离细胞的纯度、活性和生物学相关性。
关键技术方法概述
本研究招募了接受颈动脉内膜切除术的患者，获取斑块组织后迅速处理。研究人员优化了酶消化配方，采用胶原酶II型、弹性蛋白酶和DNase I的组合，对去除钙化区域的斑块组织进行消化，随后过滤、离心获得细胞悬液。原代细胞培养至第一代后，使用10X Genomics Chromium平台进行单细胞RNA测序。数据分析采用Seurat软件进行质控、整合和聚类，通过Harmony算法整合多样本数据，利用Monocle 3进行伪时间轨迹分析，并通过Tabula Sapiens血管数据集进行细胞类型注释验证。
研究结果
优化的颈动脉斑块酶消化方案
研究团队对原有适用于健康血管的VSMC分离方法进行了重要优化，特别针对动脉粥样硬化斑块的纤维化、钙化和脂质丰富的特点调整了技术参数。他们使用来自男性和女性患者的稳定和不稳定斑块各两个，验证了方法的普适性。关键改进包括使用胶原酶II型替代I型、添加DNase I以减少细胞聚集、延长消化时间至3小时，这些调整显著提高了从复杂斑块组织中获取单细胞悬液的效率和细胞存活率。
血管平滑肌细胞原代培养
经过优化的消化流程后，细胞在培养瓶中生长良好，约10天可达80-100%融合度。显微镜下观察显示，分离的细胞呈现典型的VSMC形态——细长纺锤形，细胞核位于中央，与文献报道的VSMC形态特征一致。这些细胞在传代一代后用于后续的单细胞转录组分析。
单细胞转录组分析确认VSMC为主要分离细胞群体
质控过滤后，四个斑块样本共有23,661个细胞进入后续分析。通过计算经典VSMC标志物(TAGLN、ACTA2、MYH11、CNN1、MYL9)的模块评分，发现绝大多数细胞表现出阳性评分，支持其VSMC身份。基因本体富集分析显示，这些细胞显著富集于VSMC相关的生物学过程，如细胞黏附正调控和细胞外基质组织。进一步通过Tabula Sapiens血管数据集进行细胞类型预测，确认VSMC是主要细胞群体(其次是成纤维细胞)。值得注意的是，成纤维细胞注释可能反映了VSMC表型转换而非外膜成纤维细胞污染，因为颈动脉内膜切除术通常不包含外膜组织。
亚群分析揭示多样化的VSMC相关表型和活跃的表型转换
考虑到VSMC在动脉粥样硬化斑块中的已知可塑性，研究人员深入探讨了分离后细胞中是否保留转录 distinct的VSMC特征。聚类分析识别出四个转录 distinct的VSMC亚群：高表达COL1A1、FN1、COL3A1的成纤维细胞样VSMC(集群0)；表达S100A4、SERPINE1、CTGF等炎症基因的合成表型VSMC(集群1)；高表达TAGLN、CALD1、MYL9等收缩标志物的静息收缩型VSMC(集群2)；以及高表达APOE、SPP1、CCL2等脂质处理和吞噬相关基因的泡沫细胞样VSMC(集群3)。
伪时间轨迹分析揭示VSMC表型转换路径
为探究这些亚群之间的潜在转换关系，研究人员进行了伪时间轨迹分析。以前期研究为参照，将轨迹根节点设于收缩型VSMC集群，结果显示细胞沿连续轨迹分布：从收缩型VSMC开始，向泡沫细胞样和炎性合成表型(中间状态)进展，最终抵达轨迹末端的成纤维细胞样状态。这一轨迹结构表明，成纤维细胞样细胞是通过逐渐获得合成、炎症和脂质处理特征而从收缩型VSMC演化而来，支持VSMC表型转换的概念，而非外膜成纤维细胞污染。
研究结论与意义
本研究成功建立了一套高效、标准化的方法，用于从人颈动脉粥样硬化斑块中分离高存活率的VSMC。通过单细胞转录组学分析，不仅验证了分离细胞的主要成分为VSMC，还揭示了其在体外培养中仍保持多种功能状态，包括收缩型、合成型、炎症型、泡沫细胞样和成纤维细胞样表型。更重要的是，伪时间轨迹分析直观展示了VSMC从收缩状态经中间状态向成纤维细胞样状态转变的动态过程，为理解VSMC在动脉粥样硬化中的可塑性提供了直接证据。
这一技术的建立具有多重意义：方法学上，通过优化酶组合和消化条件，显著提高了从复杂病变组织中获得高质量VSMC的效率；科学上，证实了即使经过短期培养，斑块来源的VSMC仍保留其在体内的表型特征和转换潜能，为利用原代细胞进行疾病建模奠定了基础；临床上，为研究VSMC表型转换与斑块不稳定性的关系提供了可靠平台，有助于未来发现新的治疗靶点。
该协议的成功优化使得从有限的人斑块样本中获得高质量VSMC成为可能，为心血管研究领域提供了宝贵的技术资源。未来研究可结合功能实验深入探讨不同VSMC表型在动脉粥样硬化进展中的具体作用机制，以及它们作为治疗靶点的潜在价值。
