《Nature Communications》：JULGI coordinates vascular development and leaf patterning through non-cell-autonomous regulation of miR165/166
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本研究揭示了植物叶片发育中脉管系统与背腹轴极性协同调控的新机制。研究人员发现RNA结合蛋白JULGI在叶脉中转录，其蛋白产物可非细胞自主地移动至叶片远轴端，通过结合pri-MIR165a的G富集区抑制DCL1介导的miRNA加工，从而调控miR165/166水平及其靶基因HD-ZIP III的表达。该发现为理解植物器官发育中组织间协调提供了新范式。
在高等植物的形态建成中，叶片作为主要的光合作用器官，其平坦结构的形成依赖于精确的背腹轴（adaxial-abaxial）极性建立。这种极性不仅决定了叶片的扁平形态，更与脉管系统的空间排布密切相关——木质部总是朝向近轴面（上表面），而韧皮部则朝向远轴面（下表面）。化石证据表明，现代植物的叶片可能是从古代维管植物的无叶茎轴经过侧向扁平化进化而来，这暗示着维管组织在叶片极性建立和形态塑造中可能发挥着古老的“组织中心”作用。尽管已知microRNA165/166（miR165/166）通过抑制III类同源域亮氨酸拉链（HD-ZIP III）转录因子来维持远轴特性，而近轴表达的miR390则通过ta-siRNA通路降解ARF3/4以促进近轴生长，但维管发育如何与叶片背腹轴极性精确耦合，其背后的分子信号桥梁仍不甚清晰。
为了解开这一谜题，发表在《Nature Communications》上的一项研究将目光投向了RNA结合蛋白JULGI（JUL1）。研究人员发现，JUL1作为一个源自维管组织的移动信号，通过调控miR165/166的生物合成，精巧地整合了脉管发育与叶片模式建成。
本研究综合运用了遗传学、分子生物学和生物化学等多种技术手段。研究人员利用拟南芥T-DNA插入突变体、组织特异性启动子驱动基因表达、短串联靶标模拟（STTM）技术、RNA电泳迁移率变动分析（REMSA）、RNA免疫共沉淀（RIP）、基于MS2系统的RNA实时监测、荧光共振能量转移（FRET）分析、体外pri-miRNA加工实验以及原生质体瞬时表达系统等关键技术，并结合了生物信息学分析和单细胞RNA测序数据挖掘，系统阐明了JUL1的功能机制。
G富集序列在初级MIR165和MIR166转录本中，可能是JUL1靶标
研究人员通过生物信息学分析，在拟南芥的非编码RNA中筛选出可能含有JUL1最小结合基序（KKGDGGGKW）或具有高G-四链体（RG4）形成潜力的序列。结果显示，pri-MIR165和pri-MIR166家族的五个成员同时满足这两个条件，并且其JUL1结合序列在核心被子植物（如毛果杨、拟南芥和水稻）中高度保守，而在蕨类和小立碗藓中缺失，暗示了JUL1与miR165/166模块在进化上的关联。遗传证据表明，jul1单突变体和jul1 jul2双突变体叶片出现向下卷曲的锥形表型，这是远轴特性增强的典型特征。分子检测发现，突变体中pri-MIR165a和pri-MIR166a（含JUL1结合序列）水平下降，而成熟miR165/166水平却升高；不含结合序列的pri-MIR166c/d则无变化。更重要的是，在jul1 jul2突变体中利用分生组织特异性启动子RPS5A表达STTM165/166以抑制miR165/166活性后，卷叶表型、背腹轴标记基因（FIL, KAN, PHB, REV）的表达异常以及突变体中增强的韧皮部发育均得到显著恢复。这证明JUL1通过调控miR165/166水平来影响叶片背腹轴极性。
韧皮部来源的JUL1通过miR165/166影响叶片背腹轴极性
通过分析单细胞RNA测序数据，发现JUL1转录本主要富集在韧皮部相关细胞（如伴胞、筛管）中，而在叶片背腹面的表皮细胞中不表达。启动子融合GFP实验证实，MIR165a的转录活性局限于叶原基的远轴端，而JUL1的转录活性则特异性地出现在叶原基的中脉中。然而，JUL1蛋白的分布（通过JUL1-GFP融合蛋白观察）却遍布整个叶原基，提示JUL1蛋白可能具有移动性。为了验证其非细胞自主性功能，研究者在jul1 jul2突变体中分别利用远轴特异性启动子FIL、维管特异性启动子APL和近轴特异性启动子BOP1驱动JUL1表达。令人惊讶的是，在任何一种组织中异位表达JUL1均能不同程度地挽救突变体的卷叶表型并恢复背腹轴标记基因的表达，其中FIL和APL启动子的挽救效果尤为显著。这表明，只要存在JUL1蛋白，无论其转录来源如何，都能发挥功能，明确了JUL1作为非细胞自主性调控因子的角色。
JUL1特异性结合pri-MIR165a的G富集区
通过RNA电泳迁移率变动分析（REMSA），证实重组GST-JUL1蛋白能直接与pri-MIR165a和pri-MIR166a的G富集区结合，且对pri-MIR165a的亲和力更强。进一步的点突变和竞争实验表明，JUL1结合依赖于pri-MIR165a中的三个G区块（G-block），其中G-block#1的贡献最大。在拟南芥原生质体中，利用MS2系统进行实时成像，观察到mRFP-JUL1与MS2- pri-MIR165a融合转录本共定位，而RNA结合缺陷型突变体mRFP-JUL1(RA)则无此现象。RNA免疫共沉淀（RIP）实验直接从表达JUL1-HA的植物叶片中富集到了pri-MIR165a。这些结果在体外和体内均证实了JUL1与pri-MIR165a的直接相互作用。
JUL1抑制DCL1介导的pri-MIR165a加工
在jul突变体中，pri-MIR165a水平下降而成熟miR165/166水平上升，提示JUL1可能影响miRNA加工过程。研究者设计实验探究其机制：在链霉亲和素磁珠表面固定带有Cy5标记的G富集区探针，加入Cy3标记的反义链（anti-probe）后，可观察到明显的绿色荧光（Cy3），表明双链RNA形成；而当加入JUL1后，绿色荧光信号显著减弱，JUL1(RA)则无此效应。FRET分析进一步定量证实，JUL1的存在降低了G富集区探针与其反义链之间的能量转移效率。这些结果支持JUL1通过结合pri-MIR165a的单链区域，阻碍其形成加工所必需的茎环二级结构。随后，RNA免疫共沉淀实验显示，在共表达JUL1-FLAG的原生质体中，DCL1的双链RNA结合域（dsRBD-HA）所结合的pri-MIR165a量显著减少。体外pri-miRNA加工实验最终证实，随着重组GST-JUL1蛋白浓度的增加，从野生型pri-MIR165a（pri-MIR165a_WT）加工产生成熟miR165的效率被抑制，而对JUL1结合较弱的突变体pri-MIR165a（pri-MIR165a_mut#3）的加工抑制效应则较弱。这表明JUL1通过竞争性或空间位阻效应，干扰了DCL1对pri-MIR165a的识别和加工，从而抑制miR165的生物合成。
JUL1通过抑制miR165/166水平来调控叶片背腹轴生长
在拟南芥原生质体报告中，共表达JUL1和pri-MIR165a能导致成熟miR165/166水平下降，同时含有miR165/166靶位点的PHBBS-GFP报告基因的转录水平和GFP信号增强，而靶位点突变的mPHBBS-GFP则不受影响。利用地塞米松（DEX）诱导的JUL1过表达（LhGR-JUL1）和基因敲降（LhGR-amiR-JUL1）系统，证实改变JUL1水平能直接、快速地反向调控pri-MIR165a和成熟miR165/166的水平，并进而影响其靶基因PHB和REV的表达。为了在整体植物水平验证JUL1结合的功能重要性，研究者构建了表达野生型MIR165a（proMIR165a:MIR165a_WT）或结合缺陷型MIR165a（proMIR165a:MIR165a_mut#3）的转基因拟南芥。在Col-0背景下，表达MIR165a_mut#3的植株出现了与jul1 jul2突变体类似的严重叶片卷曲，其成熟miR165/166与pri-MIR165a的比值（代表加工效率）显著高于野生型对照；而在jul1 jul2背景下，两种转基因均未能使表型进一步加剧。这有力地证明，JUL1对pri-MIR165a的结合是抑制其加工、防止miR165/166过度积累和叶片极性失衡的关键。
综上所述，该研究揭示了一个精细的调控回路：在叶片发育早期，中脉中起始的韧皮部发育伴随着JUL1的表达。JUL1蛋白随后移动至叶片组织，在远轴端与pri-MIR165a结合，通过抑制DCL1的加工来限制miR165/166的产量。较低的miR165/166水平使得HD-ZIP III转录因子得以在近轴端发挥作用，从而巩固了近轴特性，确保叶片平坦发育。这项工作不仅发现了JUL1这一连接维管发育和叶片极性的关键移动信号，还阐明了其通过结合pri-miRNA并干扰加工酶活性这一新颖的转录后调控机制。从进化角度看，JUL1及其结合位点在维管植物中的共保守性，暗示了这一调控模块可能是维管植物实现复杂器官协调发育的重要进化创新。此外，JUL1的表达受蔗糖诱导，提示它可能作为连接光合作用效率（碳源状况）与叶片形态建成的分子传感器，使植物能根据环境条件优化叶形结构。这项研究为理解植物如何整合内部发育程序与外部环境信号以优化器官形态提供了重要见解。
