EPOP通过调控PRC2.1二聚化状态限制其染色质靶向的新机制及其在早期分化中的表观遗传调控作用

《Nature Communications》：EPOP restricts PRC2.1 targeting to chromatin by directly modulating enzyme complex dimerization

本研究针对PRC2.1特异性亚基EPOP在染色质靶向中的抑制性功能谜题，通过结构生物学与功能基因组学手段，揭示EPOP通过直接破坏PRC2.1的二聚化结构削弱其染色质结合能力，从而防止关键发育基因在干细胞分化过程中被过度抑制。该工作为表观遗传复合物的构象调控机制提供了新范式。

在生命早期发育过程中，基因的精确时空调控依赖于复杂的表观遗传机制。多梳抑制复合物2（PRC2）作为关键的表观遗传调控器，通过催化组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化（H3K27me3）标记，建立并维持基因的抑制状态。PRC2以两类不同的全复合物形式存在：PRC2.1和PRC2.2，它们共享核心亚基，但拥有各自特异的辅助亚基。PRC2.1包含EPOP、PALI1/2以及PCL蛋白（PHF1、MTF2、PHF19），而PRC2.2则包含AEBP2和JARID2。尽管PRC2.1和PRC2.2在基因组上的结合位点大量重叠，但它们在细胞分化过程中对基因表达的调控作用存在差异，提示它们可能承担着非冗余的生物学功能。

在PRC2.1的辅助亚基中，EPOP（ESPRC2p48 / C17orf96）的角色尤为独特。与其它辅助亚基通常促进PRC2的染色质靶向不同，早期研究提示EPOP可能反而抑制PRC2的功能。例如，在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中，EPOP的缺失或敲低会导致PRC2核心亚基SUZ12、PRC2.2亚基JARID2以及H3K27me3在染色质上的富集增加。然而，EPOP发挥这一抑制性作用的分子机制一直模糊不清。此外，EPOP还能与Elongin BC异源二聚体相互作用，但其在PRC2调控中的必要性也存在争议。理解EPOP如何精确调控PRC2.1，对于阐明其在早期发育和细胞命运决定中的作用至关重要。

为了解决这一难题，来自美国德克萨斯大学西南医学中心的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的研究成果。本研究综合运用生物化学、结构生物学和基因组学技术，揭示了EPOP通过直接调控PRC2.1全复合物的二聚化状态，从而限制其染色质靶向能力的新机制。这一发现不仅解释了长期存在的EPOP功能谜题，也为理解表观遗传复合物如何通过构象变化精细调控基因表达提供了新的视角。

关键技术方法概述

研究人员首先通过基因敲除（KO）技术在E14 mESCs中构建了EPOP缺失细胞系，并利用尺寸排阻色谱（SEC）分析了PRC2复合物的组装状态。他们解析了EPOP C端结构域与PRC2.1亚复合物（包含SUZ12(N)、RBBP4和PHF19的反向染色质域）结合的晶体结构，分辨率达2.7 ?。通过基于结构的突变，他们构建了PRC2结合缺陷的EPOP突变体（EPOPD5）。在功能验证方面，他们采用了免疫共沉淀（Co-IP）二聚化分析、质谱光度法、电泳迁移率变动分析（EMSA）以及生物素化DNA/核小体pull-down实验，体外评估了EPOP对PRC2.1二聚化及染色质结合的影响。在体内功能层面，他们在EPOP KO的mESCs中重新表达了野生型（EPOPWT）和突变型（EPOPD5）蛋白，并将这些细胞定向分化为类上胚层细胞（EpiLCs），模拟早期发育过程。最后，他们利用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和RNA测序（RNA-seq）技术，在全基因组范围内分析了EPOP-PRC2.1相互作用对MTF2、H3K27me3染色质富集及基因表达的直接影响。对于Elongin BC的作用，则通过短发夹RNA（shRNA）敲低（KD）技术进行研究。

研究结果

EPOP在mESCs中形成独特的PRC2.1复合物并调控其色谱行为

研究人员发现，在mESCs中，EPOP与MTF2共同存在于PRC2.1复合物中。当敲除EPOP后，含有MTF2的PRC2.1复合物在尺寸排阻色谱中的洗脱峰向分子量更大的方向偏移，提示其二聚体形式积累增加。而PRC2.2的特异性亚基AEBP2和JARID2的洗脱行为未受影响。这表明EPOP特异性地调控了PRC2.1的分子构象或寡聚化状态。

EPOP从结构上破坏含MTF2或PHF19的PRC2.1二聚体

研究的关键突破在于解析了EPOP C端结构域与PRC2.1亚复合物的晶体结构。结构分析显示，EPOP的结合位点与PRC2.2的亚基JARID2和AEBP2存在空间位阻，这解释了PRC2.1和PRC2.2组装的互斥性。更重要的是，研究人员之前的工作表明，PHF19（以及同源的MTF2）通过其“二聚稳定化”（DS）螺旋作为“分子胶水”，稳定了PRC2核心复合物（PRC2core）固有的域交换二聚体界面。而在当前的结构中，EPOP的结合恰好破坏了PHF19的DS螺旋与PRC2core的相互作用，使得二聚体结构变得不稳定。这表明EPOP通过一种“解锁”机制，促使PRC2.1从稳定的二聚体状态向单体状态转变。

EPOP逐步破坏PRC2.1二聚体

为了验证结构观察，研究人员进行了体外二聚化实验。当在HEK293T细胞中共表达带有不同标签（FLAG和Myc）的EZH2以及其他PRC2.1亚基时，可以检测到PRC2.1MTF2二聚体的形成。然而，当共表达野生型EPOP时，二聚体的形成被显著抑制，而PRC2结合缺陷的EPOPD5突变体则无此效果。利用质谱光度法对纯化的蛋白质复合物进行分析，直接证实了全长EPOPWT（而非EPOPD5）能够将PRC2.1MTF2从二聚体/单体平衡状态转变为主要以单体形式存在。尺寸排阻色谱结果进一步表明，EPOP的C端片段仅能部分破坏二聚体，而全长EPOP的效果更显著，提示EPOP中除C端结构域外的其他非结构化区域也参与了二聚体到单体的转变过程。值得注意的是，加入Elongin BC并未对二聚体破坏产生额外影响。

二聚体破坏削弱了PRC2.1的染色质结合

二聚化的PRC2.1被认为可能通过“亲合力效应”增强其与染色质的结合。为了验证EPOP介导的二聚体破坏的功能后果，研究人员进行了一系列体外结合实验。利用来自小鼠Lhx6基因的CpG岛（CGI）DNA作为探针的pull-down实验显示，在EPOP KO的mESC核提取物中，有更多的MTF2-PRC2.1被捕获。电泳迁移率变动分析定量结果表明，PRC2.1MTF2-EPOP全复合物与CGI DNA和核小体的表观结合亲和力（K_d）均显著低于PRC2.1MTF2二聚体。

具体而言，PRC2.1MTF2结合DNA的K_d为3.4 ± 1.1 nM，而PRC2.1MTF2-EPOP的K_d为9.2 ± 1.8 nM。在核小体结合实验中，PRC2.1MTF2的K_d为122.9 ± 8.5 nM，而PRC2.1MTF2-EPOP的K_d为295.4 ± 16.4 nM。此外，在凝胶上，DNA或核小体与PRC2.1MTF2形成的超大复合物迁移更慢，体积显得更大，这与其二聚体性质一致，而与EPOP结合后形成的复合物体积更小，符合单体特征。这些数据强有力地证明，EPOP通过破坏PRC2.1的二聚化，削弱了其与染色质的结合。

EPOP在EpiLCs中赋予PRC2.1独特的全基因组分布谱

为了在更接近生理状态的发育模型中研究EPOP的直接作用，研究人员将表达EPOPWT或EPOPD5的mESCs定向分化为类上胚层细胞。ChIP-seq分析显示，与EPOPWT EpiLCs相比，在EPOPD5 EpiLCs中，有2317个MTF2结合位点的信号显著增强（FDR < 0.05）。同时，在20742个共有区域中，有5400个区域的H3K27me3信号也出现增益。这表明，当EPOP无法与PRC2.1结合时，PRC2.1在染色质上的靶向和H3K27me3沉积活性增强，与体外实验结果一致。

EPOP限制PRC2.1不依赖于Elongin BC

为了阐明Elongin BC在EPOP介导的PRC2.1抑制中的作用，研究人员在EpiLCs中敲低了Elongin B。结果显示，在Elongin B敲低的情况下，EPOPD5 EpiLCs中MTF2在绝大多数差异结合位点（3251/3259）的富集仍然高于EPOPWT EpiLCs，且这些位点与对照敲低情况下上调的MTF2位点有85.8%的重叠。这表明Elongin BC在很大程度上并不参与EPOP对PRC2.1靶向的抑制。然而，有趣的是，在EPOPWT EpiLCs中，Elongin B的敲低损害了MTF2在一部分基因位点的结合，提示在EpiLCs中，Elongin BC可能通过EPOP依赖的方式在某些位点促进PRC2.1的靶向。

EPOP防止EpiLCs中关键发育基因的过度抑制

RNA-seq分析发现，在EPOPD5 EpiLCs中，有130个表达下调的基因其转录起始位点（TSS）周围的MTF2和H3K27me3信号显著增强。基因本体分析显示，这些被PRC1抑制、但由EPOP维持一定表达水平的基因，显著富集于序列特异性DNA结合蛋白，包括Rel同源转录因子、碱性亮氨酸拉链转录因子、翼状螺旋/叉头转录因子和同源域转录因子。这些因子与转录调控、干细胞维持和器官发育等生物学过程相关。值得注意的是，其中一些基因（如Esrrb, Gjb3, Plagl1, Prdm1, Prdm14）在ESC向EpiLC分化过程中被抑制，但在后续的EpiLC向原始生殖细胞样细胞分化过程中又被强烈上调。这表明，EPOP通过限制PRC2.1的活性，防止这些关键发育调节因子在早期分化阶段被过早或过度抑制，从而为后续的细胞命运转变保留了必要的基因表达程序。

研究结论与意义

本研究系统地阐明了EPOP调控PRC2.1的一种新颖分子机制：EPOP通过直接破坏由MTF2或PHF19稳定的PRC2.1二聚体结构，将其转变为单体，从而削弱其染色质结合能力。这一机制在体外生化实验和体内EpiLCs模型中均得到了验证。重要的是，通过使用基于结构设计的PRC2结合缺陷型EPOP突变体，研究清晰地分离了EPOP依赖于PRC2的功能与其可能独立于PRC2的功能。研究还表明，Elongin BC在此核心抑制机制中并非必需。

该研究的发现具有多重重要意义：

1. 1.
   机制新颖性：它揭示了调控重要表观遗传复合物功能的一种新范式——通过调节其寡聚化状态来精确控制其活性。这类似于转录因子二聚化在转录调控中的重要作用，但对于大型表观遗传复合物而言，此类调控机制的明确报道尚属罕见。
2. 2.
   解决长期谜题：为EPOP这一PRC2.1特异性亚基看似矛盾的抑制性功能提供了直接的分子解释。
3. 3.
   发育生物学意义：提出了EPOP在早期发育中充当“刹车”的角色模型，通过防止PRC2.1对关键发育调节因子的过度抑制，确保基因表达谱的平稳变化，为后续细胞命运转变（如原始生殖细胞特化）创造时间窗口。这有助于理解多能干细胞分化过程中的表观遗传精度控制。
4. 4.
   潜在广泛性：鉴于EPOP在成年神经系统中高表达，该机制可能同样适用于神经系统中的基因表达调控。

总之，这项研究不仅深化了我们对PRC2复杂性及其调控的理解，也展示了结构生物学引导的功能研究在破解复杂生物学过程中的强大力量。相关发现发表于《Nature Communications》期刊，为表观遗传学领域提供了重要的新知。