基于转录组特征导向清除中间肺泡上皮细胞以改善小鼠肺纤维化的研究

《Nature Communications》：Transcriptomic signature-guided depletion of intermediate alveolar epithelial cells ameliorates pulmonary fibrosis in mice

本研究针对肺纤维化中过渡性肺泡上皮细胞的功能未知问题，开发了RNA传感介导的蛋白翻译技术(CellREADR)，通过特异性识别SPRR1A转录标记，实现了对Krt8+肺泡分化中间细胞(ADI)的精准靶向清除。研究发现清除这类细胞可显著减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化，揭示了过渡性上皮细胞在纤维化中的致病作用，为靶向治疗提供了新策略。

肺纤维化是一种以进行性肺组织瘢痕形成为特征的致命性疾病，其核心病理机制在于肺泡上皮再生障碍。近年来单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术揭示了肺损伤修复过程中存在多种过渡性上皮细胞状态，包括小鼠的Krt8⁺肺泡分化中间细胞(ADI)和人类的KRT5^-/KRT17⁺异常基底样细胞。然而，这些细胞在肺纤维化发生发展中的具体功能角色仍不明确。

为解决这一科学问题，Peng等人开发了一种创新的RNA传感依赖性蛋白翻译技术，能够特异性靶向并操纵表达特定转录组特征的细胞群体。研究人员通过分析公共单细胞数据库，发现Small Proline-Rich Protein 1A(SPRR1A) mRNA是小鼠Krt8⁺ADI细胞和人类KRT5^-/KRT17⁺异常基底样细胞的共享标志物。利用可编程RNA传感器，研究团队成功实现了对Krt8⁺ADI细胞的体内特异性标记和靶向清除。

该研究发表于《Nature Communications》，首次证实了过渡性肺泡上皮细胞在肺纤维化中的致病性作用。研究人员建立了一套完整的实验体系：通过AAV6.2FF腺相关病毒载体递送系统，将特异性识别Sprr1a mRNA的传感器序列(sesRNA)与效应报告基因(EGFP)或白喉毒素受体(DTR)连接，实现了在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中精准靶向过渡性上皮细胞。

关键技术方法包括：RNA传感器设计(CellREADR技术)、腺相关病毒(AAV)载体构建与纯化、单细胞RNA测序分析、RNA荧光原位杂交(FISH)、流式细胞分选、三维肺泡类器官培养、以及人肺组织样本的免疫荧光分析。人类肺组织样本来自阿拉巴马大学伯明翰分校的气道组织获取项目。

SPRR1A识别Krt8⁺ADI和异常基底样细胞群体

转录组分析显示，Sprr1a特异性富集于小鼠Krt8⁺ADI细胞，而Krt8表达则广泛分布于多种肺细胞类型。RNA FISH结合免疫荧光验证了Sprr1a mRNA主要位于Krt8⁺Sftpc⁺细胞，且在Krt8^highSftpclow^{细胞中表达更强。人类IPF肺组织分析同样证实SPRR1A特异性定位於KRT17+/KRT5-上皮细胞，确立了SPRR1A作为跨物种过渡性上皮细胞的可靠标志物。}

通过Sprr1a-RNA传感器体内标记Krt8⁺ADI细胞

研究人员设计了特异性识别Sprr1a mRNA的传感器序列，通过AAV6.2FF载体递送至博来霉素处理的Krt8-Cre;Rosa-tdT小鼠体内。结果显示，EGFP报告基因表达与Krt8(tdT⁺)信号在纤维化肺泡区域显著共定位，证实了Sprr1a传感器系统能够特异性靶向Krt8⁺ADI细胞。

Sprr1a⁺与Krt8⁺ADI细胞转录组比较

单细胞RNA测序分析表明，EGFP⁺细胞高表达Krt8⁺ADI状态相关标志物(如Krt8、Krt18、Sprr1a、Areg等)。相关性分析显示EGFP⁺与Krt8⁺ADI细胞在转录组水平高度相似(斯皮尔曼相关系数0.81)。UMAP可视化证实EGFP⁺细胞主要富集于Krt8⁺ADI相关的Leiden聚类中。

小鼠肺中Sprr1a⁺细胞的表型特征

新鲜分离的Sprr1a⁺细胞表现出显著的衰老样表型，包括高水平的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)、p21(Cdkn1a)和p53(Tp53)表达，但p16(Cdkn2a)表达缺失。三维肺泡类器官培养显示，Sprr1a⁺细胞形成克隆的效率低于正常AT2细胞，但形成的类体积更大，且约1%的细胞保持高增殖活性(Ki67⁺)，提示该群体存在异质性。

Sprr1a导向的Krt8⁺ADI细胞清除减轻肺纤维化

研究人员在博来霉素损伤后第8天给予AAV6.2FF-Sprr1a sesRNA-DTR，第14天给予白喉毒素(DT)，成功清除了约38%的过渡性上皮细胞。这种靶向清除显著减轻了肺纤维化，表现为胶原沉积减少、羟脯氨酸含量降低以及纤维化标志物(胶原蛋白I、纤连蛋白、α平滑肌肌动蛋白)表达下降。值得注意的是，未接受DT处理的对照组中也有11.8%的Sprr1a⁺细胞发生凋亡，表明这类细胞在肺损伤修复过程中存在自然更替。

研究结论强调，过渡性肺泡上皮细胞在肺纤维化发展中扮演关键致病角色。通过转录组特征导向的细胞靶向技术特异性清除Krt8⁺ADI细胞，能够有效缓解博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。该研究不仅揭示了过渡性上皮细胞作为肺纤维化治疗潜在靶点的重要性，还展示了一种基于scRNA-seq发现的可转化细胞靶向策略的强大应用潜力。

讨论部分进一步阐述了过渡性AT2细胞中瞬时衰老与永久衰老的状态差异，以及其在肺修复过程中的动态平衡。研究表明，过渡性AT2细胞的自然凋亡可能是防止其异常累积的重要内在机制。这种基于RNA传感的细胞靶向平台为研究疾病特定细胞群体的功能提供了强大工具，并为开发精准治疗策略开辟了新途径。