基于PLGA的纳米疫苗递送嵌合IpaD-StxB蛋白，可诱导针对志贺菌感染的强效免疫反应

《Journal of Immunological Methods》：PLGA-based nanovaccine delivering chimeric IpaD-StxB protein induces robust immune response against Shigella infection

本研究成功开发了一种基于PLGA纳米粒的融合蛋白疫苗（IpaD-StxB），通过双乳液溶剂蒸发法制备，具有高包封效率（97%）和持续释放特性。动物实验表明，纳米疫苗显著增强小鼠的血清IgG免疫应答，验证了其作为高效、稳定且广谱志贺疫苗的潜力。

　　

Ayoub Fazeli|Hosein Honari|Davoud Sadeghi|Hossein Samiei-Abianeh|Rasoul Rafiei-Foroushani

伊朗德黑兰伊玛目侯赛因大学基础科学学院生物系

摘要

背景与目的

志贺菌病是全球主要的致病和致死原因之一，尤其是在低收入和中等收入国家的5岁以下儿童中。尽管该疾病对公共卫生构成严重威胁，但目前尚无获准使用的疫苗。基于重组蛋白和纳米颗粒的疫苗方法为传统疫苗提供了有前景的替代方案。本研究旨在开发一种嵌合纳米疫苗，该疫苗由Shigella flexneri的IpaD和StxB蛋白融合而成，并将其封装在PLGA纳米颗粒中，然后在小鼠模型中评估其免疫原性。

方法

重组IpaD-StxB（IdSb）蛋白在大肠杆菌中表达，在变性条件下纯化后，通过双乳液溶剂蒸发技术封装到PLGA纳米颗粒中。对颗粒大小、形态、封装效率及体外释放特性进行了分析。BALB/c小鼠被接种Nano-IdSb或游离IdSb，通过ELISA检测血清IgG水平以评估体液免疫反应。

结果

24 kDa的重组IdSb蛋白在原核系统中成功表达，产量为10 mg/mL。封装IdSb的PLGA纳米颗粒平均直径为166 nm，封装效率高达97%，载药量为3.5%。这些纳米颗粒能够实现长达40天的持续蛋白释放。接种Nano-IdSb的小鼠表现出比接种游离蛋白更强的IgG反应，表明其具有更高的免疫原性和抗原稳定性。

结论

PLGA封装的IdSb纳米疫苗引发了强烈的体液免疫反应，并具有良好的理化特性，显示出作为针对Shigella属细菌的具有成本效益且广谱保护的疫苗候选物的潜力。

引言

志贺菌病是一种由Shigella属细菌引起的严重腹泻疾病，尤其在卫生条件较差的低收入和中等收入国家中是一个重要的全球健康问题。根据《全球疾病负担》（GBD）报告，Shigella感染每年导致约20万人死亡，其中大部分为5岁以下儿童。该疾病通过粪-口途径传播，在地方性流行区域S. flexneri和S. sonnei是最常见的血清型（Scott等人，2025年）。

Shigella利用III型分泌系统（T3SS）侵入结肠上皮细胞，释放效应蛋白如侵袭性质粒抗原D（IpaD），这种蛋白对细菌入侵至关重要（Sani等人，2007年）。此外，S. dysenteriae 1型会产生志贺毒素（Stx），这是一种AB5型细胞毒素，会通过损害肠道和肾脏组织加剧疾病严重程度（Sváb等人，2020年）。尽管经过数十年的研究，目前仍无获准使用的疫苗，部分原因是病原体的遗传多样性以及缺乏普遍有效的抗原（MacLennan等人，2022年）。减毒活志贺菌疫苗候选物已显示出引发显著免疫反应的潜力，包括黏膜免疫。然而，它们在地方性流行地区的婴儿和儿童中常常面临多重毒性和免疫反应不佳的问题（Germani和Sansonetti，2011年）。此外，先前针对其他血清型的免疫反应不足以抵御同源血清型的感染（Gregory等人，2014年）。

最近的研究重点是将关键毒力因子结合的多价亚单位疫苗。IpaD是一种暴露在表面的T3SS蛋白，能诱导中和抗体从而阻止细菌入侵（Akbari等人，2019年）。而无细胞毒性的StxB亚单位则通过靶向肠道相关淋巴组织（GALT）中的M细胞来增强黏膜免疫反应（Tartour和Johannes，2022年）。将IpaD与StxB融合可以协同发挥它们的免疫原性，提供更广泛的保护。

志贺菌病疫苗研发的主要障碍在于抗原的口服递送，因为胃肠道的降解和吸收不良限制了疫苗效果。PLGA纳米颗粒（NPs）是一个有前景的解决方案，它兼具生物相容性、可控释放和抗酶降解的能力（Silva等人，2016年）。PLGA NPs已被成功应用于FDA批准的疗法和疫苗递送中，能够增强树突状细胞对抗原的摄取，并刺激体液和细胞免疫（Ignjatovic等人，2010年）。将抗原与佐剂（如MPLA或CpG）共同封装在PLGA NPs中可以进一步放大免疫反应。

在本研究中，我们开发了封装嵌合IpaD-StxB（IdSb）抗原的PLGA纳米颗粒，并在BALB/c小鼠模型中评估了它们的免疫原性和保护效果。这种纳米疫苗配方产生了粒径均匀、封装效率高且抗原释放持续的纳米颗粒。接种Nano-IdSb的小鼠表现出比接种游离抗原更强的全身IgG反应，表明Nano-IdSb在提高抗原稳定性、递送效果和整体免疫原性方面具有优势。这些发现凸显了基于PLGA的重组纳米疫苗作为未来志贺菌病疫苗开发实用且可扩展平台的潜力。

研究部分

重组IdSb蛋白的表达与纯化

编码Shigella flexneri IpaD-StxB（IdSb）融合蛋白的重组质粒pET28-IdSb通过标准热休克协议转入E. coli BL21(DE3)感受态细胞中。感受态细胞的制备方法是将其重新悬浮在冰冷的100 mM CaCl?溶液中，在冰上孵育30分钟后，在加入质粒后于42°C下进行热休克处理45秒。转化子通过添加卡那霉素（80 μg/mL）的LB琼脂平板进行筛选。

为了表达蛋白...

重组IdSb蛋白的表达与纯化

SDS-PAGE分析显示IdSb重组蛋白成功表达，其在25 kDa附近出现明显条带——接近预期的24 kDa分子量——与阴性对照相比（图1A）。IPTG浓度从0.5 mM增加到1 mM时，表达水平显著提高（图1B）。通过变性条件下的pH梯度洗脱和尿素梯度纯化，IdSb蛋白的纯度约为80%（根据凝胶结果估算）

讨论

志贺菌病由于其快速传播、高发病率和日益严重的抗菌素耐药性而成为全球重大的健康问题。该疾病对5岁以下儿童的影响尤为严重，同时对旅行者、军事人员和朝圣者也构成风险。尽管付出了大量努力，但目前仍无获准使用的疫苗，这凸显了迫切需要一种针对多种Shigella血清型的具有成本效益的广谱疫苗。尽管有多种疫苗候选物...

CRediT作者贡献声明

Ayoub Fazeli：撰写——审稿与编辑、验证、方法学设计、研究实施、概念构思。Hosein Honari：撰写——审稿与编辑、验证、项目监督、概念构思。Davoud Sadeghi：撰写——审稿与编辑、验证、软件应用、方法学设计。Hossein Samiei-Abianeh：撰写——初稿撰写、方法学设计、研究实施。Rasoul Rafiei-Foroushani：研究实施、方法学设计、软件应用、撰写——审稿与编辑。

利益冲突声明

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