《Journal of Inorganic Biochemistry》：Insulin modulates Aβ
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42 aggregation toward non-toxic forms: A comparative study with
cis-[Ru(phen)
2(3,4Apy)
2]2+
编辑推荐：
研究胰岛素和Ru(II)配合物Ru3,4Apy对Aβ????聚集的影响，发现两者结合促进非毒性聚集途径，抑制β折叠形成，保护细胞。
马可·A·蒂布西奥（Marco A. Tiburcio）|芭芭拉·帕特里夏·N·席尔瓦（Bárbara Patrícia N. Silva）|玛丽亚·劳拉·达·C·加西亚（Maria Laura da C. Garcia）|洛雷娜·M·B·佩雷拉（Lorena M.B. Pereira）|玛丽娜·M·格里戈利（Marina M. Grigoli）|玛西亚·R·科米内蒂（Márcia R. Cominetti）|罗斯·M·卡洛斯（Rose M. Carlos）
巴西圣卡洛斯联邦大学（Federal University of S?o Carlos）化学系，圣卡洛斯，圣保罗州（S?o Carlos, SP, Brazil）
摘要
鼻内胰岛素疗法在治疗阿尔茨海默病（AD）方面受到了越来越多的关注，因为它具有调节β-淀粉样蛋白（Aβ）聚集的潜力，而Aβ聚集是AD病理学的标志性特征。分子动力学模拟表明，胰岛素能够与U形Aβ1–42寡聚体结合，通过其A链破坏β-折叠结构的排列。相比之下，Ru(II)配合物cis-[Ru(phen)2(3,4Apy)2]+（Ru3,4Apy；phen = 1,10-菲啰啉；3,4Apy = 3,4-氨基吡啶）主要与纤维表面相互作用。尽管两者都针对Aβ1–42的中心疏水核心结构，但它们结合的区域不同。因此，它们与Aβ1–42的共聚集可能会对聚集过程和细胞毒性产生不同的影响，这为理解胰岛素缓解Aβ诱导的细胞毒性的分子机制提供了见解。我们利用Tyr10内在荧光、圆二色光谱、原子力显微镜以及SH-SY5Y细胞存活实验，在胰岛素、Ru3,4Apy单独或共同存在的情况下监测了Aβ1–42的聚集过程。Ru3,4Apy减少了β-折叠的形成，但并未阻止Aβ1–42诱导的细胞毒性；而胰岛素则限制了分子的构象灵活性，防止了Tyr10的埋藏，抑制了β-折叠的形成，并促进了无定形的、无毒的聚集体形成。值得注意的是，在Aβ1–42/Ru3,4Apy/胰岛素混合物中，聚集过程遵循了一条绕过成熟纤维典型埋藏核心β-折叠的无毒路径。这些发现强调了Aβ1–42/胰岛素相互作用的特异性，并表明针对特定的结合位点是治疗AD的一个有前景的策略。
引言
β-淀粉样蛋白（Aβ）肽的聚集在阿尔茨海默病（AD）中的作用至关重要，这促使人们努力理解有毒Aβ物种形成的分子机制，并开发抑制Aβ神经毒性的方法。[1,2] 与Aβ1–40相比，Aβ1–42多两个C端氨基酸，是淀粉样斑块中的主要异构体，尽管其含量较少，但具有更高的聚集倾向和更强的神经毒性。[3,4] 从结构上看，Aβ1–42由一个亲水的N端结构域（Asp1-Leu16）、一个中心的疏水核心（Leu17-Ala21）以及一个疏水的C端区域（Ala30-Ala42）组成。[5] 这些结构域通过静电相互作用、π-π堆叠、疏水力和氢键促进聚集。[6, [7], [8]]
为了抑制Aβ的聚集，人们探索了多种分子策略，包括使用有机分子[9, [10], [11]、金属螯合剂[12, [13], [14]、金属配合物[15, [16], [17]以及肽[18, [19], [20]]。最近的研究强调了胰岛素信号传导与Aβ毒性之间的相互作用，表明胰岛素可以调节Aβ的聚集和清除。[21,22] 在这一背景下，鼻内胰岛素作为一种潜在的AD治疗策略被提出，旨在增强大脑中的胰岛素信号传导并减少Aβ诱导的神经毒性。[23,24]
此外，胰岛素促进Aβ降解的能力也因其可能在分子水平上减少Aβ聚集和毒性而受到关注。例如，罗（Luo）及其同事证明，可溶性Aβ1–40与单体胰岛素的共聚集会相互减缓各自的聚集速率。[25] 而且在胰岛素存在下形成的前纤维Aβ1–40寡聚体对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的毒性显著降低。[25] 同样，朗（Long）及其同事发现，胰岛素与Aβ1–42共培养时可以抑制纤维的形成。[26]
巴兰（Baram）和米勒（Miller）通过分子动力学模拟研究了胰岛素与Aβ1–42纤维样寡聚体的特异性相互作用。[27] 他们提出，胰岛素选择性地与某些Aβ多态体结合，其中B链的Phe24-Phe25-Tyr26（FFY）残基与“U形”纤维的中心疏水核心（CHC）发生π-π堆叠和疏水相互作用。这种相互作用可能会破坏β-折叠的结构并阻碍纤维的形成。然而，这些效应似乎依赖于多态体的具体构象，因为在某些情况下胰岛素也可能促进聚集。[27]
在之前的研究中，我们证明了钌(II)配合物cis-[Ru(phen)2(3,4Apy)2+（Ru3,4Apy；3,4Apy = 3,4-氨基吡啶；phen = 1,10-菲啰啉）（图1）能够实时监测Aβ1–40的聚集过程，而不会干扰肽本身短暂的荧光特性。[28] 通过荧光寿命成像显微镜和透射电子显微镜，我们观察到了早期聚集中间体（如蠕虫状和球状结构），并在120分钟后观察到带状聚集体，表明Ru3,4Apy主要与U形Aβ寡聚体结合。[28,29]
鉴于胰岛素和Ru3,4Apy都作用于Aβ1–42的CHC结构域，但结合位点不同，我们推测它们与Aβ1–42的共聚集可能会对聚集和细胞毒性产生不同的影响。这种差异有助于阐明表面结合或内部结合在调节或抑制Aβ1–42聚集和细胞毒性中的主导作用，并进一步揭示胰岛素缓解Aβ细胞毒性的分子机制。
cis-[Ru(phen)2(3,4Apy)2](PF6)2(Ru3,4Apy)配合物的合成
cis-[Ru(phen)2Cl2]前体配合物和cis-[Ru(phen)2(3,4Apy)2(PF6)2]配合物是按照先前报道的程序合成的。[30,31] Ru3,4Apy配合物是通过在12毫升脱气H2O/乙醇混合物（1:1，v/v）中回流150毫克（0.284毫摩尔）的cis-[Ru(phen)2Cl2]和61.5毫克（0.568毫摩尔）的3,4-二氨基吡啶，在惰性气氛下制备的。所得产物通过过量NH4PF6沉淀后，再经过过滤和冷洗涤得到。
Aβ1–42的均匀聚集
为了深入了解Aβ1–42聚集的分子机制，我们使用荧光光谱技术监测了其构象变化。该技术能够检测与淀粉样纤维形成相关的结构转变，从而提供有关聚集过程的宝贵信息。传统上，人们使用外源性荧光染料（如硫黄素T（ThT）来实现这一目的，因为ThT在淀粉样纤维存在下在490纳米处有强烈的发射峰（λexc = 450纳米）。
结论
我们的研究结果表明，Ru3,4Apy在纤维表面的结合模式与胰岛素在纤维内部的结合模式不同，这导致了对聚集路径和毒性的不同影响。这些结果进一步证实了胰岛素在保护Aβ1–42介导的细胞毒性方面的作用，并强调了结合特异性在调节淀粉样蛋白聚集中的重要性，正如Brain等人所提出的。
CRediT作者贡献声明
马可·A·蒂布西奥（Marco A. Tiburcio）： 负责撰写初稿、方法学设计、实验研究、数据分析及数据管理。
芭芭拉·帕特里夏·N·席尔瓦（Bárbara Patrícia N. Silva）： 负责撰写、审稿与编辑、方法学设计、实验研究、数据分析及数据管理。
玛丽亚·劳拉·达·C·加西亚（Maria Laura da C. Garcia）： 负责撰写、审稿与编辑、方法学设计、实验研究、数据分析及数据管理。
洛雷娜·M·B·佩雷拉（Lorena M.B. Pereira）： 负责撰写、审稿与编辑、方法学设计、实验研究、数据分析及数据管理。
玛丽娜·M·格里戈利（Marina M. Grigoli）： 负责结果验证、实验监督及方法学指导。
资助
本研究部分得到了巴西圣保罗研究基金会（FAPESP）的资助（项目编号：2022/06637-0、2025/25309-1、2021/04675-9、2023/02083-2、2021/02436-7、2025/06851-0）；巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）的资助（项目编号：307464/2021-0、140407/2021-9、303826/2023-1）；以及巴西高等教育人员协调委员会（CAPES）的资助（资助代码001）。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢卡洛斯·罗德里格斯·科斯塔（Carlos Rodrigues Costa）和LNNano/CNPEM团队在AFM图像方面的协助（CNPEM；提案编号20221197），感谢加布里埃尔·H·里贝罗（Gabriel H. Ribeiro）对Ru3,4Apy配合物在PBS中的1H NMR测量，以及安娜·保拉·乌利安教授（Prof.a Dr.a Ana Paula Ullian）及其团队为圆二色光谱实验提供的支持。
