《Cells》：Topical CCL3 Is Well-Tolerated and Improves Liver Function in Diabetic Mice: Evidence from a 14-Day Toxicity Study
摘要
糖尿病伤口表现出免疫功能受损、中性粒细胞募集延迟和感染风险增高，这损害了早期感染控制并延迟愈合。研究表明，局部CCL3治疗可恢复中性粒细胞流入，将细菌感染减少约99%，并加速糖尿病小鼠的伤口愈合。根据美国食品药品监督管理局（FDA）研究性新药（IND）指南，我们在糖尿病小鼠中进行了一项14天急性毒性研究，单次局部施用有效低剂量（1 μg）和高剂量（10 μg）CCL3。在整个研究期间监测小鼠的临床症状、体重和食物摄入。第14天，评估了血清生化（ALT、AST、BUN、肌酐、代谢标志物）和主要器官（肝、肾、心、肺、脾）的组织病理学。CCL3治疗的糖尿病小鼠未表现出不良临床效应。血液学和生化参数保持在正常范围内，组织病理学分析显示，与糖尿病对照组小鼠相比，CCL3治疗组未出现额外的器官损伤。有趣的是，CCL3治疗的小鼠显示出改善的ALT水平和减轻的肝脏病理，提示具有肝保护作用，并且血清IgG降低，表明全身炎症减轻。总体而言，我们的研究表明，糖尿病小鼠可耐受高达有效治疗浓度10倍的局部CCL3剂量，且无全身器官毒性证据。这些发现为CCL3作为糖尿病伤口护理新疗法的转化开发提供了强有力的临床前支持。
1. 引言
糖尿病足溃疡（DFUs）是糖尿病最常见和最致残的后果之一，占所有下肢截肢（LEA）的60–75.5%，仅在美国每年的护理费用就高达约90-120亿美元。大量溃疡进展为LEA凸显了当前治疗的不足以及对创新方法的迫切需求。感染是DFUs中的一个主要合并症，是慢性状态和LEA的驱动因素。与处于持续且无法缓解的炎症状态的慢性溃疡不同，损伤后早期愈合的急性阶段炎症反应显著减弱，使得糖尿病伤口易受病原菌如铜绿假单胞菌感染，这些细菌通过产生毒力因子进一步加剧组织损伤并损害组织修复，这些因子可进一步抑制炎症反应并对组织修复的多种细胞过程产生不利影响。
中性粒细胞是抵御入侵病原体的第一道防线，它们立即迁移到损伤部位，通过吞噬作用、活性氧和氮物种的产生、抗菌肽以及中性粒细胞胞外陷阱的发展来促进细菌清除。然而，在高血糖和糖尿病条件下，中性粒细胞的抗菌和杀菌功能受损，使其无法有效控制感染。此外，从糖尿病患者血液中分离的中性粒细胞表现出趋化反应受损，导致糖尿病伤口愈合早期阶段进入伤口和感染部位的中性粒细胞运输减少。这种中性粒细胞功能障碍归因于甲酰肽受体（FPR）信号传导受损，该受体通常介导中性粒细胞向损伤和感染的初始波运输。重要的是，一些辅助趋化因子受体，如CCR1，在糖尿病条件下仍保持功能；然而，由于其内源性配体表达水平低，它们在糖尿病伤口早期阶段未被激活。
目前尚无批准的针对糖尿病伤口感染的生物疗法。唯一获批用于DFUs的生物疗法是Becaplermin凝胶（0.01% rhPDGF-BB）。然而，Becaplermin在刺激愈合方面疗效有限，且对感染无效。抗生素常规用于糖尿病溃疡的管理，但它们与抗生素耐药性的出现、毒性以及干扰组织修复有关。这些报告强调了对解决糖尿病伤口感染的新型疗法（优选无抗生素）的迫切需求。我们先前已证明，局部应用CCL3/MIP-1α免疫调节剂可通过绕过受损的FPR信号传导并恢复及时的中性粒细胞运输，将感染减少>99%并改善糖尿病小鼠的愈合，突出了其在糖尿病伤口护理中的潜力。然而，新型生物制剂的监管批准需要在其相关动物模型中全面评估其功效和毒性。
本研究调查了局部CCL3伤口疗法在糖尿病小鼠中的14天毒性特征，包括生理监测、生化和血液学分析以及主要器官的组织病理学评估。这些发现为糖尿病伤口模型中CCL3治疗的免疫学安全性和全身可接受性提供了基础见解，为临床应用铺平了道路。
2. 材料与方法
2.1. 化学品
磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH 7.4、重组小鼠CCL3/MIP-1α蛋白、盐酸氯胺酮、甲苯噻嗪（Rampun?）、丁丙诺啡、无菌酒精预湿垫、5毫米活检穿孔器、10%中性缓冲福尔马林、二甲苯、苏木精、伊红、Invitrogen小鼠CRP ELISA试剂盒、Invitrogen小鼠IgG1未包被ELISA试剂盒、Invitrogen小鼠IgE ELISA试剂盒。
2.2. 动物与分组
使用8周龄B6.BKS(D)-Leprdb/J（db/db）肥胖糖尿病小鼠（品系 #00697），包括两种性别（每组3雄3雌）。年龄匹配的杂合子（db/+）小鼠作为正常血糖对照。所有动物均在加州大学戴维斯分校健康动物饲养场饲养。小鼠随机分为四个实验组（6只/组）：(1) 对照（db/+ 接受PBS）；(2) 糖尿病（db/db 接受PBS）；(3) 糖尿病接受低剂量CCL3治疗（1 μg/伤口）；(4) 糖尿病接受高剂量CCL3治疗（10 μg/伤口）。研究策略示意图见图1。
2.3. 伤口造模与治疗
伤前1天（第-1天）用电动修剪器去除背部毛发。第0天，小鼠用氯胺酮（80 mg/kg）和甲苯噻嗪（10 mg/kg）腹腔注射麻醉，随后用丁丙诺啡（0.01 mg/kg）镇痛。用无菌酒精预湿垫擦拭消毒背部皮肤，使用无菌活检穿孔器制作全层切除伤口（直径5毫米）。根据分组，局部施用PBS或CCL3（1 μg 或 10 μg/伤口）。每天观察行为、体重和食物消耗的变化。
2.4. 监测与临床观察
治疗后，观察小鼠的存活、活动、姿势和任何不适迹象。在研究开始时和14天期间定期测量体重和食物摄入量。每日观察记录任何可能提示与CCL3治疗相关的全身毒性的行为变化。
2.5. 免疫学、血液学和生化分析
为了评估CCL3治疗在糖尿病小鼠中的全身安全性，使用既定程序评估免疫学、血液学和生化参数。第14天，麻醉小鼠并通过心脏穿刺采集血液。使用自动血液分析仪分析红细胞和白细胞计数（RBC和WBC）、血红蛋白（Hb）、血小板计数和白细胞分类分布。使用Roche Cobas Integra 400 Plus分析血清生化，包括肝功能指标（ALT、AST、ALP、总胆红素）、肾功能指标（BUN、肌酐）、蛋白质水平（总蛋白和白蛋白）、电解质和葡萄糖。此外，使用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法分析血清样本的免疫学参数，包括炎症和过敏标志物，如C反应蛋白（CRP）、免疫球蛋白G1（IgG1）和免疫球蛋白E（IgE）。
2.6. 组织病理学分析
组织病理学检查用作可视化并确认CCL3治疗是否改变组织结构或引起器官毒性迹象的金标准方法。采集关键器官（肝、肾、脾、心、胰）并固定在10%中性缓冲福尔马林中。器官经处理、石蜡包埋、切片（4–5 μm）并进行苏木精&伊红（H&E）染色。所有组织学切片均进行编码，评分在不知治疗分组的情况下进行。根据先前公布的标准进行坏死和炎症的半定量评分。坏死分级为0–5分：0 = 无坏死，1 = 极轻微（<5%组织），2 = 轻度（5–20%），3 = 中度（21–40%），4 = 重度（41–60%），5 = 极重度（>60%）。炎症类似分级为0–5分：0 = 无浸润，1 = 极轻微浸润（少量散在细胞），2 = 轻度（<10%组织），3 = 中度（10–30%），4 = 重度（31–50%），5 = 极重度（>50%）。
2.7. 统计分析
使用单因素方差分析（One-way ANOVA）及适当的事后检验进行组间统计分析。数据表示为平均值±标准误（SEM），p值≤ 0.05被认为具有统计学显著性。
3. 结果
实验设计示意图见图1。简要来说，小鼠被随机分配到四个实验组（每组6只）：(1) 对照（db/+ 接受PBS）；(2) 糖尿病（db/db 接受PBS）；(3) 糖尿病接受低剂量CCL3治疗（1 μg/伤口）；(4) 糖尿病接受高剂量CCL3治疗（10 μg/伤口）。在14天期间监测食物摄入、体重以及任何死亡或行为变化迹象。第14天，处死小鼠，收集血液和主要器官进行生化、免疫学和组织学分析，以评估CCL3治疗对整体健康的全身效应。
3.1. CCL3治疗后的生理和行为监测
第0天伤口手术后，所有组的小鼠均表现出活动减少和梳理行为减少，这与急性术后不适一致。然而，到第2天，行为模式恢复，动物恢复正常活动和进食，未再发现异常。非糖尿病对照小鼠（db/+）每天消耗约3–4克食物，而糖尿病小鼠（db/db）消耗量显著更高（6.5–8克/天），这与db/db肥胖糖尿病小鼠食欲增加一致。值得注意的是，所有组在手术后第0天和第1天食物摄入暂时减少，但这种食欲减退是暂时的，到第2天动物恢复了正常进食行为（图2A）。与db/+非糖尿病对照小鼠相比，db/db糖尿病小鼠在整个研究期间持续消耗更多食物，无论其治疗如何。PBS治疗和CCL3治疗的db/db小鼠在任何剂量下均无显著差异，表明局部应用1 μg和10 μg的CCL3对摄食行为没有影响。在整个研究过程中，所有组的db/db小鼠体重（40–50克）始终显著高于非糖尿病db/+小鼠（20–30克）对照组（基线第0天）（p < 0.0001）。尽管第1天食欲减退，小鼠在伤口造模程序后未经历显著体重减轻，其体重在整个14天期间保持稳定（图2B）。值得注意的是，PBS和CCL3治疗的db/db组在进食行为或体重方面没有显著差异，表明CCL3治疗耐受良好，并未改变小鼠的代谢状态（图2B）。
3.2. CCL3疗法在糖尿病小鼠中的免疫学评估
我们评估了第14天血液中的血清免疫学参数和循环生物标志物，以确定CCL3治疗是否不利地改变免疫反应或引起全身毒性。在与全身炎症相关的免疫学参数方面，与非糖尿病对照组相比，PBS（模拟）治疗的糖尿病小鼠表现出约48.5%更高的血清IgG1水平（285.75 ± 86.27 μg/mL vs. 192.45 ± 13.51 μg/mL, p < 0.01）；125%更高的IgE（207.35 ± 57.64 vs. 92.29 ± 22.03, p < 0.01）；以及335%更高的C反应蛋白（CRP）水平（8.14 ± 1.86 vs. 1.83 ± 0.33, p < 0.001）（表1）。这些发现与临床报告一致，显示糖尿病患者血清IgG1、IgE和CRP水平升高，与肾病风险增加、过敏反应、全身炎症和糖尿病视网膜病变相关。
有趣的是，CCL3治疗将糖尿病小鼠的血清IgG1降低到与非糖尿病对照组相似的水平（图3），表明CCL3诱导了对通常与糖尿病相关的失调适应性免疫反应的有益调节。CCL3治疗的糖尿病组的IgE和CRP水平与PBS治疗的糖尿病组相比无显著差异（表1）。总的来说，这些结果表明CCL3疗法不会对这些免疫生物标志物产生不利影响，反而可能对血清IgG1产生有益影响。
3.3. CCL3疗法在糖尿病小鼠中的生化安全性评估
为了进一步评估CCL3疗法的全身安全性，在第14天评估了血清生化参数。正如预期，db/db小鼠的葡萄糖水平（402.48 ± 34.02 mg/dL）显著高于db/+对照组（231.68 ± 24.41 mg/dL）；然而，CCL3治疗并未进一步影响血清葡萄糖水平（表2）。血清电解质（钠、钾、氯、钙、磷）以及总蛋白和胆红素浓度在PBS和CCL3治疗的糖尿病小鼠之间相似，表明CCL3给药未改变这些参数（表2）。
肝酶——包括丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）——在糖尿病前期和糖尿病患者中经常升高，并与肥胖、内脏肥胖、血脂异常、糖尿病风险增加和代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）相关。与这些观察结果一致，到治疗后第14天，PBS治疗的糖尿病（db/db）对照小鼠表现出显著升高的血清ALT（275.65 ± 22.94 U/L）、AST（247.58 ± 11.97 U/L）和ALP（217.00 ± 6.32 U/L）水平，与非糖尿病对照组相比（ALT: 23.27 ± 1.33 U/L; AST: 83.39 ± 6.18 U/L; ALP: 97.93 ± 16.37 U/L）（表2和图4A）。有趣的是，CCL3治疗的糖尿病小鼠在1 μg（210.35 ± 11.43 U/L）和10 μg（211.18 ± 22.02 U/L）剂量下均表现出适度但显著的ALT水平降低，与PBS治疗的糖尿病对照组相比（p < 0.05；图4A和表2）。值得注意的是，血清AST和ALP水平未受CCL3局部治疗影响，并且与非糖尿病小鼠相比，在糖尿病小鼠中保持显著升高。
为了进一步评估CCL3对肝损伤的影响，我们对肝组织进行了组织学分析。与非糖尿病小鼠相比，糖尿病对照小鼠（db/db + PBS）表现出明显的脂肪变性、肝细胞气球样变、正常小叶结构破坏以及坏死和炎症评分升高（图4A–D）。这些组织病理学特征与2型糖尿病患者中报告的MASLD和肝损伤一致。相比之下，用任一剂量CCL3治疗的小鼠显示出减小的肝细胞大小，并且坏死评分有降低趋势，尽管未达到统计学显著性（图4B–E）。总的来说，这些发现表明CCL3治疗不会加剧肝损伤，并提示在糖尿病小鼠中具有适度的肝保护作用。
3.4. CCL3不引起器官毒性：组织病理学证据
肾脏、脾脏、胰腺和心脏是受糖尿病状况不利影响的其他重要器官。我们对这些器官进行了组织病理学评估，以评估局部CCL3治疗在糖尿病db/db小鼠中潜在的全身毒性。显示了肝、肾、脾、胰和心的代表性H&E染色切片，以及坏死和炎症的半定量评分（图5）。
db/db + PBS小鼠的肾脏组织学揭示了特征性的糖尿病肾病样变化，包括肾小管空泡变性和肾小球肥大（图5A）。相比之下，CCL3治疗小鼠的肾脏显示出可比较的组织学特征，没有额外的结构损伤。定量评分证实，坏死和炎症水平在所有治疗组之间保持相似，没有证据表明局部CCL3应用后肾脏病理恶化（图5B,C）。
糖尿病导致脾脏显著的组织学改变，如白质萎缩、淋巴细胞结节/生发中心减少、淋巴细胞密度降低和免疫细胞分布改变。db/+对照小鼠的脾脏显示正常组织学，具有清晰界定的白髓（淋巴细胞丰富区）和红髓（红细胞丰富区）。相比之下，糖尿病PBS治疗的对照小鼠显示出结构破坏，白髓百分比低于非糖尿病对照组（53.82 ± 2.94% vs. 69.11 ± 4.13%, p < 0.0001），表明免疫组织受损（图5D）。无论剂量如何，CCL3治疗的糖尿病小鼠显示出类似的白髓减少（分别为57.33 ± 2.75% 和 57.64 ± 4.9%），与db/db PBS对照组无统计学差异，表明治疗未影响脾脏变化（图5D–G）。
正如预期，非糖尿病db/+对照小鼠具有正常的胰岛和腺泡组织，而db/db对照小鼠显示胰岛变形和血管充血（图5G）。与这些数据一致，糖尿病小鼠的坏死和炎症评分显著高于对照组（图5H, I, p < 0.0001）。半定量评分显示没有CCL3相关胰腺毒性的额外证据（图5H,I）。
与这些报告一致，db/db + PBS小鼠的心脏切片表现出与糖尿病心肌病一致的心肌破坏，包括局灶性肌纤维改变和坏死评分增加（图5J,K）。重要的是，局部CCL3治疗在所检查的剂量下并未增加心肌断裂、坏死或炎症变化。
总的来说，跨多个器官的组织病理学分析表明，局部CCL3治疗，即使是10倍更高剂量，也不会诱导全身器官毒性或加剧糖尿病相关的组织病理学，支持其在该模型中良好的安全性特征。
3.5. CCL3疗法血液学评估
为了进一步评估CCL3疗法的全身安全性，在第14天评估了血液学参数。糖尿病db/db小鼠的白细胞（WBC）计数显著高于其db/+对照对应物（表3），这一发现与先前报告的血液学改变一致。重要的是，施用1 μg或10 μg剂量的CCL3并未进一步改变循环WBC水平，表明CCL3治疗不会加剧糖尿病相关的白细胞增多。此外，在比较糖尿病和非糖尿病小鼠或PBS治疗和CCL3治疗的糖尿病组时，未检测到血红蛋白浓度或主要白细胞亚群（包括中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）相对比例的显著差异（表3）。与这些发现一致，血小板计数和平均红细胞体积（MCV）在所有实验条件下保持可比，平均血小板体积（MPV）在组间未显示可检测的变化（表3）。总的来说，这些数据证明，在测试剂量下，CCL3给药不会诱导可测量的血液学异常，支持CCL3疗法在这些实验条件下与血液学毒性无关的结论。
4. 讨论
先前，我们证明了促炎细胞因子CCL3在恢复中性粒细胞功能、改善细菌清除和刺激糖尿病伤口愈合方面具有治疗潜力。然而，缺乏全面的安全性评估限制了其作为糖尿病伤口护理研究性新型生物制剂的转化进展。本研究首次在糖尿病伤口模型中评估了局部CCL3（MIP-1α）的急性全身安全性特征。我们的研究结果表明，在db/db小鼠中，单剂量局部施用实验有效剂量和10倍更高剂量的CCL3耐受良好，在主要器官中没有血液学、生化或组织病理学毒性的证据。值得注意的是，CCL3治疗的小鼠表现出全身炎症标志物的部分正常化和肝细胞损伤的减轻，突出了CCL3作为糖尿病伤口管理新型生物制剂的治疗潜力和安全性。
有趣的是，我们发现CCL3治疗降低了血清ALT水平，同时部分保留了肝脏结构，提示对肝损伤标志物的适度减弱而非明确的肝保护作用。肝酶升高和脂肪肝变化在糖尿病小鼠和2型糖尿病患者中已有充分记录。在我们的研究中，CCL3治疗的小鼠显示出减小的肝细胞大小，支持CCL3诱导的中性粒细胞募集可能有助于清除坏死细胞和恢复组织稳态的观点。类似发现已在CXCL1和其他中性粒细胞趋化因子中报告，其中早期中性粒细胞浸润增加加速了细菌清除，同时减少了继发性组织损伤。然而，应谨慎解释在CCL3治疗的糖尿病小鼠中观察到的血清ALT水平降低和肝脏组织病理学的部分改善。这些效应是适度的，未将ALT值正常化至非糖尿病水平，并且不伴随AST或ALP的变化，表明对肝损伤标志物的任何影响是部分的而非全面的。在缺乏证明CCL3直接肝脏作用的机制研究的情况下，这些变化可能反映了间接效应，例如由于伤口愈合改善和免疫稳态改变导致的全身炎症减少或免疫信号改变。因此，这些发现最好被视为初步和假设生成性的，强调了未来研究需要阐明这些观察结果背后的机制，并确定它们与糖尿病肝病理的相关性。
任何细胞因子或趋化因子疗法的一个主要关注点是全身免疫失调或超敏反应的风险。总体而言，全身免疫学分析支持局部CCL3疗法在糖尿病小鼠中的安全性，因为治疗并未加剧循环标志物，包括在糖尿病中常见升高并与疾病并发症相关的IgE和CRP。重要的是，CCL3选择性地将糖尿病小鼠的血清IgG1水平降低到与非糖尿病对照相当的值，表明在IgG1方面对失调的适应性免疫反应进行了正常化。鉴于IgG1升高与慢性低度全身炎症以及发生大血管和微血管并发症（特别是糖尿病肾病和心血管疾病（CVD））的较高风险相关，这种选择性调节可能代表了CCL3治疗的有益免疫学效应。总之，这些发现表明，在测试剂量下，局部CCL3耐受良好，并且可能通过减弱异常的IgG1升高而带来额外的全身益处，同时避免广泛抑制或激活炎症通路。
血液学和生化分析已被接受为临床前毒性测试中的金标准参数。在我们的调查中，总血液参数和生化标志物在所有组中保持在生理范围内，表明全身稳态得以维持。值得注意的是，糖尿病PBS小鼠表现出更高的肝脏标志物（ALT、AST、ALP）水平，与先前db/db小鼠非酒精性脂肪性肝病的结果一致。令人惊讶的是，CCL3疗法改善了肝细胞脂肪变性和气球样变，同时降低了ALT水平。这表明CCL3除了无毒外，可能还具有肝保护特性。这些发现与报告一致，即恢复及时的中性粒细胞反应可以通过鼓励早期清除坏死物质和最小化持续炎症来避免进一步的组织伤害。
组织学评估是毒性测试的重要组成部分，因为它提供了对物质对组织和细胞影响的直接、可观察和详细的视图。组织病理学检查显示，db/db小鼠在多个
