《Tissue Barriers》：Permeation of small extracellular vesicles across a human blood-brain barrier transwell model remains below particle detection limits, even under oxygen/glucose deprived conditions
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本研究通过建立人源血脑屏障（BBB）共培养模型（hCMEC/D3脑毛细血管内皮细胞与1321N1星形细胞瘤细胞），系统评估了缺氧/缺糖（OGD）对BBB完整性、基因表达及小细胞外囊泡（sEV）转运的影响。研究发现OGD可显著破坏屏障功能（降低TEER、增加FD4渗透性），并诱导适应性转录反应（如上调GLUT1、VEGFA）。sEV的摄取呈现细胞来源依赖性，但其跨BBB的完整囊泡透细胞渗透即使在严重屏障破坏条件下仍无法被检测到，提示sEV在BBB处可能主要被溶酶体降解而非发生有效转运。
1. 引言
缺血性脑卒中是全球范围内导致死亡和长期残疾的主要原因之一，其病理核心是脑部血流中断引发的氧和葡萄糖供应不足。血脑屏障（BBB）作为维持中枢神经系统（CNS）稳态的关键界面，在脑缺血过程中首当其冲受到影响。BBB由脑毛细血管内皮细胞（BCECs）通过紧密连接（TJs）相互连接构成，具有高跨内皮电阻（TEER）和特化的转运体系统。卒中时，BBB完整性遭到破坏，紧密连接蛋白（如occludin, claudin-5, ZO-1）和ABC转运体（如P-gp/ABCB1）表达异常。BBB功能依赖于神经血管单元（NVU）中多种细胞（如星形胶质细胞、周细胞）的相互作用。小细胞外囊泡（sEV）是细胞衍生的膜性囊泡，携带蛋白质、RNA等生物分子，在细胞间通讯中发挥重要作用，其产生和分泌在缺血条件下会发生改变。然而，sEV在卒中不同阶段跨越受损BBB的机制尚不明确。
2. 材料与方法
本研究采用人源化体外BBB共培养模型，将人脑毛细血管内皮细胞系hCMEC/D3与人星形细胞瘤细胞系1321N1在Transwell系统（1.0 μm孔径）中共培养。模型经受不同时间的缺氧/缺糖（OGD）处理以模拟缺血性卒中：5小时OGD（急性期）、5小时OGD后19小时常氧恢复（恢复期）以及24小时持续OGD（最大损伤期）。通过测量跨内皮电阻（TEER）和FITC-葡聚糖4（FD4）通透性评估BBB完整性。利用高通量qPCR芯片分析BBB相关基因（紧密连接蛋白、转运体等）的转录组变化。从八种不同人源癌细胞系（如HEK293T, SH-SY5Y, MDA-MB-231等）中通过超速离心和尺寸排阻色谱法分离纯化sEV，并通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）、Western Blot（检测CD9, CD81, Alix, TSG101等标志物）和冷冻透射电镜进行表征。使用CellTracker Orange（CTO）或PKH26荧光染料标记sEV，通过流式细胞术和共聚焦显微镜研究sEV被BBB细胞的摄取及其胞内定位（如与早期内体标志物Rab5a、溶酶体标志物LAMP1的共定位）。通过NTA检测sEV从供体腔室到受体腔室的渗透情况。使用特定的内吞抑制剂（如氯丙嗪、制霉菌素、细胞松弛素D等）探讨sEV的摄取机制。
3. 结果
3.1 OGD对BBB完整性和通透性的影响
OGD处理导致BBB完整性显著破坏。5小时OGD后，单培养和共培养的hCMEC/D3细胞的TEER均显著下降（分别降至对照的78.05%和67.64%）。经过19小时恢复后，屏障功能未能完全恢复（单培养和共培养TEER分别约为对照的63.62%和47.47%）。24小时持续OGD造成更严重的屏障破坏（单培养和共培养TEER分别降至对照的~22.27%和~12.25%）。共培养模型在OGD下表现出比单培养更严重的TEER下降和FD4通透性增加，表明星形细胞瘤细胞加剧了OGD对BBB的破坏作用。
3.2 OGD诱导的转录组变化
急性OGD（5小时）诱导了显著的转录适应。多个紧密连接相关基因（CLDN5, CLDN6, CLDN9, TJP1/ZO-1）以及葡萄糖转运体1（SLC2A1/GLUT1）和血管内皮生长因子（VEGFA）表达上调，而其他基因（如CLDN7, CLDN11, CLDN12, JAM1）以及某些ABC转运体（ABCB1/P-gp, ABCG2/BCRP）表达下调。聚类分析显示OGD是主要的驱动因素。在19小时恢复期后，多种紧密连接蛋白（OCLN, CLDN3, CLDN4, CLDN6, JAM1）表达持续下调，而SLC2A1和VEGFA表达仍保持高位，提示OGD损伤对基因表达有持久影响。24小时OGD后，转录变化减弱，可能与细胞能量耗竭有关。1321N1细胞在OGD和恢复后也表现出VEGFA、SLC2A1和SLC7A5/LAT1上调。
3.3 OGD条件下的细胞外囊泡释放
OGD处理增加了细胞外颗粒的释放。5小时OGD后，顶端颗粒浓度变化不显著，但颗粒中位尺寸减小。19小时恢复期后，共培养细胞的顶端颗粒浓度显著高于对照。24小时OGD导致单培养和共培养细胞顶端颗粒释放均增加约3倍，且颗粒尺寸减小。基底侧的颗粒浓度在共培养中始终高于单培养，反映了1321N1细胞的贡献。OGD显著增加了共培养模型基底侧的颗粒释放。
3.4 不同来源sEV的摄取与渗透
从八种细胞系分离的sEV均表现出典型的sEV特征（大小约130-150 nm，负Zeta电位，表达sEV标志蛋白，无细胞污染物）。sEV被hCMEC/D3细胞摄取的效率取决于其细胞来源和施加方向。从顶端施加时，HEK293T和SH-SY5Y来源的sEV摄取最高；从基底侧施加时，SH-SY5Y和1321N1来源的sEV摄取较高。SK-MEL-28来源的sEV摄取不显著。内吞抑制实验表明，小窝蛋白介导的内吞和巨胞饮是sEV摄取的主要途径。共聚焦显微镜显示，摄取的sEV（如SH-SY5Y来源）随时间推移逐渐与溶酶体标志物LAMP1共定位，表明其趋向于溶酶体降解。尽管sEV能被有效摄取，但在常氧条件下，即使使用1.0 μm孔径的Transwell，在24小时内也未检测到sEV跨hCMEC/D3细胞层的透细胞渗透。
3.5 OGD条件下sEV的摄取与渗透
在OGD条件下（5小时OGD+19小时恢复，或24小时OGD），sEV（HEK293T和SH-SY5Y来源）的摄取效率与常氧条件相比无显著变化。即使BBB完整性因24小时OGD而严重破坏（TEER极低，细胞活力下降），也未能检测到sEV从供体腔室到受体腔室的渗透。使用高渗甘露醇完全破坏细胞层后，仅有少量sEV渗透（约2%），远低于无细胞插入物中的渗透率（约13.7%），表明即使细胞死亡，其残留物或细胞外基质仍会阻碍sEV的通过。
3.6 OGD与sEV共处理对颗粒释放的影响
OGD是驱动颗粒释放的主要因素。共培养进一步增强了OGD诱导的颗粒释放。外源性添加HEK293T或SH-SY5Y来源的sEV对OGD条件下的颗粒释放模式没有产生明显影响。基底侧添加SH-SY5Y sEV后，共培养中其回收率低于单培养，提示星形细胞瘤细胞可能摄取了部分sEV。
4. 讨论
本研究建立的人源BBB共培养模型成功模拟了缺血性卒中相关的BBB功能障碍。OGD引起屏障完整性丧失、适应性转录反应以及细胞外颗粒/sEV释放增加。sEV的摄取具有细胞来源特异性，并主要通过小窝蛋白介导的内吞和巨胞饮途径进行。然而，最关键的发现在于，即使BBB严重受损，完整的sEV颗粒的透细胞渗透仍低于当前NTA方法的检测限。共聚焦显微镜观察支持sEV被细胞内化后主要靶向溶酶体进行降解，而非发生有效的跨细胞转运。这提示在病理条件下，sEV更可能作为信号载体在BBB水平被“处理”，其携带的信息可能通过内容物释放或信号传导影响接收细胞，而非完整的囊泡大量进入脑实质。严格设置的对照（如培养基对照）对于区分真实的sEV信号和背景噪音至关重要。
5. 结论与局限性
本研究系统阐述了OGD对人源BBB模型的影响及sEV在其中转运的命运。主要结论是sEV能被BBB细胞有效摄取，但其完整的跨BBB透细胞转运效率极低，即使在缺血损伤条件下也是如此，溶酶体降解可能是其主要归宿。研究的局限性包括依赖荧光标记和NTA进行检测，以及应用的sEV浓度虽生理相关但可能不足以检测罕见的渗透事件。未来研究需要更灵敏的方法来最终阐明sEV在BBB处的确切转运机制。
