《Translational Neurodegeneration》：Microglia-derived extracellular vesicle content as a biomarker for early detection of Alzheimer’s disease
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阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种进行性神经退行性疾病，以β-淀粉样蛋白（amyloid-beta, Aβ）聚集、tau蛋白病理、突触功能障碍及神经元丢失为特征。尽管当前诸如A/T/N分类等生物标志物框架已推进了诊断水平，但这
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种进行性神经退行性疾病，以β-淀粉样蛋白（amyloid-beta, Aβ）聚集、tau蛋白病理、突触功能障碍及神经元丢失为特征。尽管当前诸如A/T/N分类等生物标志物框架已推进了诊断水平，但这些标志物主要反映疾病相对晚期阶段，限制了早期干预的机会。这凸显了对不仅可及且敏感、同时对AD最早期致病机制具有特异性的生物标志物的迫切需求。近期研究强调了疾病相关小胶质细胞（disease-associated microglia, DAM）在AD发生与进展中的关键作用。DAM具有双重作用：一方面通过吞噬淀粉样蛋白和碎片、代谢脂质及重塑突触发挥保护功能；另一方面也可通过过度释放细胞因子、慢性炎症信号传导及聚集物清除受损而驱动病理进展。DAM释放的细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）包裹蛋白质、核酸和脂质，反映其细胞状态。这些囊泡反映小胶质细胞（功能障碍）状态，并可在脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）和血液中检测到，为监测早期AD病理提供了一种微创手段。在本综述中，研究人员审视了新兴证据，即小胶质细胞来源EVs的内容物可能满足理想生物标志物的标准，重点关注可检测性、敏感性、特异性和纵向监测的可行性。研究人员讨论了其通过提供更稳定的货物保护、细胞类型特异性及在外周体液中的可及性来克服当前体液和影像生物标志物局限性的潜力。此外，研究人员强调了分离小胶质细胞来源EVs、鉴定可靠表面标志物和货物标志物以及标准化方法以确保研究间可重复性方面的机遇与挑战。通过将小胶质细胞生物学见解与EV研究相整合，研究人员为小胶质细胞来源EV内容物作为AD早期检测的生物标志物提供了证据，并提出了朝向DAM特异性EV特征图谱的路线图，该图谱可能改变AD的早期诊断和疾病监测。这些进展不仅对AD具有前景，对神经退行性和神经炎症性疾病也具有更广泛的应用价值。
背景：当前AD的已验证生物标志物
AD是一种进行性神经退行性疾病，以Aβ积累、过度磷酸化tau、胶质细胞增生（包括小胶质细胞增生和星形胶质细胞增生）、神经炎症及突触功能障碍为特征，最终导致神经退行及认知和功能衰退。AD的早期诊断对于在尽可能早的阶段进行干预至关重要。已确立的AD特异性生物标志物包括淀粉样蛋白和tau病理、突触及神经元丢失以及神经炎症的指标，可在CSF、血液中评估，或通过正电子发射断层扫描（positron emission tomography, PET）和磁共振成像等影像技术原位评估。自2018年起，A/T/N生物标志物分类系统已应用于临床以整合生物标志物发现。该框架包括：(A) Aβ，通过CSF中Aβ42或淀粉样蛋白-PET成像评估；(T) tau，通过CSF中总tau或磷酸化tau或tau-PET成像测量；以及(N)神经退行，通过脑萎缩的结构影像或神经丝轻链等神经退行标志物评估。当前A/T/N框架内的体液和影像生物标志物对已确立的AD病理具有较高的诊断准确性。然而，这些标志物主要反映下游神经元和蛋白质病变过程，可能对先于其发生的小胶质细胞或神经免疫启动事件敏感性较低，且蛋白水平可能在脑外发生改变。血液样本也可能受非神经元蛋白（如外周tau）的混杂影响。某些生物标志物缺乏疾病特异性；例如，神经丝轻链反映一般性神经退行，而α-突触核蛋白仅存在于约半数AD病例中。另一挑战在于在轻度认知障碍（mild cognitive impairment, MCI）阶段区分AD与非AD痴呆。这些障碍凸显了识别AD早期、疾病特异性生物标志物新策略的必要性。
DAM
DAM已通过单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）和单核RNA测序（single-nuclei RNA sequencing, snRNA-seq）在AD小鼠模型中被鉴定，与稳态小胶质细胞相比表现出独特的转录、分泌和功能特征。DAM上调与免疫应答和吞噬相关的基因，同时下调维持稳态的基因，导致失调和病理表型，促成过度神经炎症和神经毒性。DAM主要被神经退行相关分子模式（neurodegeneration-associated molecular patterns, NAMPs）激活。DAM在AD中表现出双重作用：通过吞噬淀粉样蛋白和碎片、代谢脂质和重塑突触促进保护，也可通过过度细胞因子释放、慢性炎症信号传导和聚集物清除受损驱动病理。在AD进展过程中，DAM从"阶段1"过渡到"阶段2"，这一转变受髓样细胞触发受体2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2, TREM2）紧密调控。TREM2识别多种脂质和损伤相关配体，并通过TYROBP（DAP12）信号传导调节小胶质细胞存活、趋化、吞噬和脂质处理。TREM2中的罕见编码变异（如R47H）显著增加迟发性AD风险，通常被认为是减弱TREM2信号传导并损害向DAM状态完全转变的低效等位基因。APOE是散发性AD最强的常见遗传风险位点；APOE ε4等位基因以剂量依赖性方式增加AD风险。转录组学研究已鉴定出TREM2–APOE轴，其中TREM2依赖性上调APOE及其他脂质代谢基因（包括CTSD和LPL）伴随从稳态小胶质细胞向DAM的转变。5×FAD小鼠模型的见解进一步阐明DAM动态：在3月龄（对应早期斑块沉积），小胶质细胞开始获得"早期"或阶段1 DAM特征；阶段2 DAM在6月龄出现，与更晚期淀粉样病理和行为及认知缺陷的出现相吻合。类似转录变化也在多种神经退行性疾病小鼠模型中被描述为小胶质细胞神经退行表型（Microglial Neurodegenerative phenotype, MGnD），该特征与DAM转录谱显著重叠，表明DAM和MGnD代表沿共同TREM2–APOE轴的相关神经退行相关小胶质细胞状态。
识别AD特异性小胶质细胞应答
尽管DAM并非AD所特有，但某些标志物和转录谱在AD中特别富集，提示一定程度的疾病特异性。DAM比健康小胶质细胞更类似衰老小胶质细胞，两者均表现出增强的反应性和促炎表型。然而，DAM与衰老小胶质细胞在转录和分泌谱方面存在显著差异。一个关键区别是ApoE的作用：衰老小胶质细胞独立于ApoE发育，而DAM形成通过ApoE依赖性途径发生，突出了一个区分AD特异性小胶质细胞应答的分子机制。从稳态小胶质细胞向AD中DAM的转变是一个受多种遗传、分子和环境因素影响的复杂过程。对这些因素的了解为调节AD中小胶质细胞功能的潜在治疗靶点提供了见解。
EVs作为生物标志物载体
EVs是细胞物质的强效载体，反映其来源细胞的生理状态。几乎所有细胞类型均可释放EVs，其可将货物包裹在腔内或展示在囊泡表面。EVs在大小、内容和功能上具有异质性，通常根据生物发生和物理特征分为三类：外泌体（约30–150 nm）、微囊泡（约100–1000 nm）和凋亡小体（约50–5000 nm）。EVs作为生物标志物载体的一个重要优势是其在外空间中屏蔽货物的能力。与易被蛋白酶和核酸酶等酶降解的游离分子不同，包裹的货物受到保护。因此，与游离分子相比，EVs具有更高的稳定性和更长的半衰期，支持更一致的检测并实现纵向研究。此外，EVs可携带多种生物分子（包括RNA、DNA和蛋白质），拓宽了潜在生物标志物的谱系。
小胶质细胞来源EV内容物作为AD的生物标志物
小胶质细胞来源EVs代表CNS中几种胶质细胞来源EV亚群之一。在健康脑中，少突胶质细胞和星形胶质细胞来源EVs主导胶质EV库。小胶质细胞约占CNS总细胞的5%–12%，其稳态EV贡献比例较低。当前证据表明，小胶质细胞EV的丰度和货物均随AD的发生和进展而显著变化。这些囊泡反映小胶质细胞活性，其在AD早期阶段高度显著，并携带可在CSF和血液等可及生物体液中检测的分子货物。因此，EVs提供了在临床症状（如MCI）出现之前进入神经炎症过程的微创窗口。除反映病理外，EVs还可促进病理的传播。例如，小胶质细胞可吞噬Aβ，将其内化至内体-溶酶体系统，并将未降解的Aβ或其片段路由至随后作为EVs释放的腔内囊泡。AD中脑来源EVs也被证明含有具有种子能力的tau物种。由于几乎所有细胞类型（包括神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞等CNS细胞）均释放EVs，分离小胶质细胞特异性EVs可实现AD相关神经炎症的敏感且特异的早期检测。小胶质细胞在静息条件下释放EVs，但激活后分泌显著增加。一项近期研究从对照组及MCI或AD患者血浆中分离了小胶质细胞来源小EVs（TMEM119阳性），并评估了miRNA表达。miR-29a-5p的表达可预测MCI（受试者工作特征分析，曲线下面积（area under the curve, AUC）= 0.840），而miR-132-5p和miR-125b-5p的表达可预测AD（AUC = 1.000）。此外，对来自人AD脑组织的小胶质细胞小EVs的多组学分析揭示了疾病相关特征，包括稳态小胶质细胞标志物P2RY12和TMEM119丰度显著降低，以及CD11b阳性EVs中DAM样标志物FTH1和TREM2水平升高。AD脑来源小胶质细胞EVs中tau丰度显著升高，游离胆固醇水平升高，含二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid, DHA）的多不饱和脂质水平显著降低。此外，四个与免疫和细胞衰老信号通路相关的miRNAs（miR-28-5p、miR-381-3p、miR-651-5p和miR-188-5p）在AD组中显著上调。
小胶质细胞来源EV生物标志物的可测量性
EVs不限于局部信号传导，其长距离扩散能力使其能够到达CNS的远处区域。重要的是，EVs也能进入血液循环和CSF，因为它们能够双向穿过血脑屏障（blood–brain barrier, BBB）、血-脑脊液屏障和室管膜细胞。尽管EVs从脑到外周及反向的通过存在一定争议，但积累的数据表明从血液和CSF等可及生物体液中分离CNS来源EVs是可能且可行的。同时，相当一部分CNS EVs可能保留在脑内。EVs在外周血中的出现可能受邻近小胶质细胞、神经元和星形胶质细胞的局部摄取、与细胞外基质的相互作用、血管周围间隙的捕获以及BBB完整性受损时清除障碍的限制。EVs相对于使用整个生物体液进行生物标志物发现具有若干实际优势。血浆含有约占其总蛋白含量90%的高丰度蛋白，CSF是来自多种细胞类型的分子的复杂混合物，这使得检测低丰度蛋白具有挑战性。相比之下，EV货物在脂质膜内的包裹可防止与高丰度蛋白和其他污染物的相互作用，提高测量准确性。此外，EVs携带细胞特异性表面标志物，允许将其来源追溯至特定CNS细胞类型，包括小胶质细胞。
小胶质细胞来源EVs的分离
从血液或CSF中分离EVs为探索其在AD中的生物标志物潜力提供了宝贵机会。多种EV特异性蛋白标志物展示在其表面，包括四旋蛋白（tetraspanins）如CD9、CD63和CD81、热休克蛋白（heat-shock protein, HSP）70及MHC分子。值得注意的是，CD9和CD63也出现在AD小鼠模型的DAM转录模块中，表明经典外泌体标志物本身是DAM基因库的一部分，进一步支持DAM激活状态与EV生物学之间的机制联系。EVs被释放到多种生物体液中，包括血液、尿液、唾液和CSF，并可基于这些表面标志物进行分离和富集。可用于分离和浓缩EVs的方法包括超速离心、密度梯度离心、尺寸排阻色谱、微流控平台、化学沉淀和生化捕获。
