CAR信号引导αβ与γδ T细胞差异性代谢重编程与功能命运

《Cellular & Molecular Immunology》：CAR signaling instructs divergent metabolic reprogramming and functional fates in αβ and γδ T cells

　　

基于γδ T细胞的免疫治疗已成为传统αβ T细胞产品的相关替代方案，临床前数据表明其可降低肿瘤负荷并减轻肿瘤诱导的组织损伤。鉴于大多数嵌合抗原受体（CAR）构建体已针对αβ T细胞优化，研究人员假设不同T细胞类型可能需要定制的CAR结构以实现最佳功能。为验证此假设，研究人员对转导第二代靶向前列腺干细胞抗原（PSCA）的CAR（PSCA-8t28z）的γδ和αβ T细胞进行了系统比较分析。研究人员发现，尽管γδ和αβ CAR-T细胞表现出相当的细胞毒性水平，但其表型不同。通过系统级磷酸化蛋白质组学分析，研究人员鉴定出307个磷酸化位点在γδ和αβ CAR-T细胞间丰度存在差异。通路富集分析将糖酵解/糖异生和T细胞受体（TCR）信号置于显著过代表信号网络前列。功能验证研究结果证实，γδ CAR-T细胞的糖酵解和氧化磷酸化能力低于αβ CAR-T细胞，且激活蛋白1（AP-1）激活较弱。值得注意的是，研究人员鉴定出硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）作为增强γδ CAR-T细胞代谢的潜在可操作靶点。最后，研究人员设计了一种新的合成共刺激受体，其可增强AP-1激活，从而改善体内持久性。这些结果强调了γδ与αβ T细胞之间的基本生物学差异，并支持开发细胞类型特异性受体工程策略，以最大化γδ CAR-T细胞功能和治疗获益。

研究背景：γδ T细胞过继细胞治疗（ACT）作为传统αβ T细胞产品的替代，具有先天样细胞毒性，可识别应激诱导抗原或非肽抗原，不依赖经典MHC限制，并能交叉呈递抗原。Vδ2和Vδ1 T细胞优先归巢于炎症或恶性组织，适合实体瘤。未修饰γδ T细胞临床试验安全性好，但临床反应有限，需增强效应功能和持久性。CAR修饰是重要方向，γδ CAR-T细胞在肝细胞癌、卵巢癌、胃癌和转移性前列腺癌等临床前模型中显示活性。多数CAR设计基于αβ T细胞优化，隐含功能同源假设；但γδ T细胞生物学差异认识不足，基于αβ的CAR构建体是否最优尚不清楚。CAR-T细胞需在营养缺乏、缺氧肿瘤微环境中工作，代谢性能成为关键。研究人员假设不同T细胞类型需要定制CAR结构，因此开展系统比较。该论文发表于《Cellular》。

研究内容与结论：研究人员用第二代PSCA靶向CAR（PSCA-8t28z）转导γδ和αβ T细胞，比较细胞毒性、表型、磷酸化蛋白质组、代谢、TCR信号，鉴定TXNIP并设计嵌合开关受体（CSR）。结论为：γδ和αβ CAR-T细胞细胞毒性相当但表型不同；307个磷酸化位点差异；糖酵解/糖异生和TCR信号富集；γδ CAR-T细胞糖酵解和氧化磷酸化（OXPHOS）较低，AP-1激活较弱；TXNIP抑制改善代谢和功能；RANK-CD27 CSR增强AP-1并改善体内持久性。意义在于揭示γδ与αβ T细胞基本生物学差异，支持细胞类型特异性受体工程。

关键技术方法：从去标识健康供者buffy coats（LifeSouth community blood centers或OneBlood）分离外周血单个核细胞（PBMC）；γδ T细胞用唑来膦酸（Zol）和IL-2扩增，αβ T细胞用OKT3和IL-2扩增；逆转录病毒转导PSCA-8t28z CAR及RANK-CD27/RANK-41BB CSR；SILAC标记C4-2B PSCA⁺细胞，共培养后进行磷酸化蛋白质组学（TMT、IMAC、质谱）和IPA通路富集；流式细胞术、ELLA/ELISA、Seahorse代谢分析、葡萄糖摄取、MitoTracker和TMRE；SRI-37330抑制和CRISPR-Cas9敲除TXNIP；Western blot检测CD3ζ ITAM磷酸化；TransAM AP-1 ELISA；C4-2B和U266小鼠骨转移模型。样本来源为健康供者。

研究结果：
1. γδ CAR-T细胞产生的细胞因子水平低于αβ CAR-T细胞。研究人员将同供者γδ和αβ CAR-T细胞与PSCA⁺ C4-2B细胞共培养过夜，两者均分泌颗粒酶B（GZMB）、干扰素-γ（IFNγ）、肿瘤坏死因子-α（TNFα）和白细胞介素-2（IL-2），但γδ CAR-T细胞水平持续显著较低，尽管多功能性相当；γδ CAR-T细胞表达更高程序性死亡蛋白1（PD-1）和CD69，CD25相似，CD27和CD28更低；CAR表达在亚群间相当。结论：杀伤相当但功能表型不同。
2. CAR激活在γδ和αβ CAR-T细胞中诱导差异信号转导。研究人员用SILAC标记肿瘤细胞，共培养后行磷酸化蛋白质组学，比较激活1 h、 tonic 0 h和未转导（UT）背景。鉴定307个差异磷酸化位点，224个在γδ CAR-T细胞低磷酸化；CD8α和CD4低磷酸化；低磷酸化包括PLCγ1、c-Jun、GLUT-1，高磷酸化包括NFAT1、MAPK14、PAG1、ITGAL、EOMES。通路富集显示糖酵解/糖异生和TCR信号居前，负Z score表明αβ更强。结论：同一CAR在不同T细胞类型驱动不同激活信号。
3. γδ T细胞代谢活性低于αβ T细胞。糖酵解通路中五种酶和GLUT-1在γδ CAR-T细胞低磷酸化；GLUT-1 S473磷酸化、蛋白和表面表达较低；未培养PBMC中Vδ2 T细胞GLUT-1表达低于CD8、Vδ1和CD4 T细胞；其他葡萄糖转运体无显著差异。Seahorse显示γδ CAR-T细胞基础糖酵解和补偿糖酵解较低，葡萄糖摄取低；OCR基础、最大和储备呼吸容量低；线粒体质量和膜电位低；未培养Vδ2线粒体质量低。结论：糖酵解和氧化磷酸化均较低，是细胞内在特性。
4. TXNIP抑制改善γδ T细胞代谢和功能。磷酸化蛋白质组显示TXNIP所有位点在γδ CAR-T细胞低磷酸化，T349磷酸化触发降解，因此γδ T细胞TXNIP表达高约1.74倍。研究人员在扩增中加入SRI-37330抑制TXNIP，降低TXNIP mRNA，增加线粒体质量、储备呼吸容量和基础糖酵解，提高CAR表达；与C4-2B共培养释放更多TNFα、GZMB和IL-2。CRISPR-Cas9敲除TXNIP也增加CAR表达和TNFα、GZMB、IFNγ、IL-2释放。结论：TXNIP调节γδ CAR-T细胞代谢和效应功能，是可操作靶点。
5. CAR激活在γδ和αβ CAR-T细胞中触发不同TCR信号事件。刺激1 h后，ITK、LCK、ZAP70磷酸化相当；下游NFAT磷酸化在γδ CAR-T细胞更高，AP-1（JUN S58）更低；PAK2 S141低，PLCγ1 S1248抑制位点低即活性高，MK14 Y182高。CD3ζ Y83在CAR-T细胞高于UT；Y111仅在αβ刺激后高。时间进程显示Y72、Y83、Y142在1 min达峰，1 h相当，但Y83 30 min和Y142 0、10、30 min在γδ减弱。结论：早期阈值均达到，但γδ整合信号动力学或幅度不同。
6. 通过嵌合开关受体递送CD27共刺激改善AP-1激活和T细胞存活。基于JUN磷酸化低，研究人员设计RANK-CD27或RANK-41BB CSR，利用肿瘤/骨微环境RANKL。共转导CAR和CSR约50%双阳性；SWITCH27结合RANKL更强，CD27⁺CD45RA^-中枢记忆增加，选择SWITCH27。TransAM AP-1 ELISA显示γδ SWITCH27-CAR核内phospho-c-JUN、c-Fos、JUN-D均高于UT，phospho-c-JUN高于CAR；αβ SWITCH27未受益。C4-2B骨转移模型中，SWITCH27-CAR控制肿瘤不劣于CAR，骨髓中γδ T细胞显著更多；脾脏有趋势。U266模型部分重现。结论：通过独立CSR整合共刺激信号可改善γδ CAR-T细胞持久性而不损害抗肿瘤功能。

讨论与结论：讨论总结γδ T细胞是实体瘤ACT有吸引力平台，但免疫生物学知识存在缺口。γδ CAR-T细胞细胞因子分泌低但细胞毒性相当，可能降低细胞因子毒性风险；PD-1、CD69高，CD28、CD27低。代谢上糖酵解和OXPHOS低，线粒体质量低，可能是内在能量需求低，与低细胞因子分泌相关。TXNIP高表达，抑制或敲除改善代谢和功能。TCR信号差异涉及PLCγ1、MK14、NFAT/AP-1等，AP-1低与耗竭相关。CSR利用RANKL提供CD27共刺激，增强AP-1，改善体内持久性，且仅在γδ T细胞中增强AP-1。研究结论翻译：这些结果强调γδ与αβ T细胞之间的基本生物学差异，并支持开发细胞类型特异性受体工程策略，以最大化γδ CAR-T细胞功能和治疗获益。总之，这些结果表明，通过独立CSR整合共刺激信号可改善γδ CAR-T细胞持久性而不损害抗肿瘤功能。