《Nature Genetics》：Single-cell profiling and genetic regulation of alternative polyadenylation in the human brain
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替代多聚腺苷酸化（alternative polyadenylation，APA）在mRNA命运调控中具有核心作用，并在大脑及神经元中表现出高度变异性。然而，大脑APA调控尚未在细胞类型分辨率下被绘制，且大脑细胞类型中APA的遗传控制及其对遗传疾病的贡献仍不明
替代多聚腺苷酸化（alternative polyadenylation，APA）在mRNA命运调控中具有核心作用，并在大脑及神经元中表现出高度变异性。然而，大脑APA调控尚未在细胞类型分辨率下被绘制，且大脑细胞类型中APA的遗传控制及其对遗传疾病的贡献仍不明确。研究人员报道了来自379例伴或不伴阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的人类死后大脑的200万细胞单细胞APA图谱。研究人员发现，APA为理解AD中基因调控改变提供了独立于表达变化的机制层，因为具有APA改变的基因不同于表达改变基因，但常汇聚到相似通路，包括小胶质细胞激活和神经元微管运输。研究人员将APA变异与全基因组测序整合，鉴定出4,288个基因的细胞类型分辨率3′非翻译区数量性状位点（3′ untranslated region quantitative trait loci，3′aQTL）。研究人员发现3′aQTL比eQTL更倾向于与pQTL共定位。在17个脑性状与疾病中，研究人员鉴定出168个依赖3′aQTL的GWAS位点，其中仅17.5%与eQTL共享。这些包括AD的PLEKHA1和APOC2、精神分裂症的PAK6和AP3B2、双相障碍的NDUFA13、多脑性状的MTCH2，以及帕金森病顶级位点SNCA。研究人员表明3′非翻译区选择改变SNCA mRNA在细胞内的定位，与SNCA风险位点在神经元和少突胶质细胞中以eQTL非依赖方式起作用一致。结果提供了细胞类型特异性基础，用于探究APA的顺式（cis）与反式（trans）调控及该关键转录后层对疾病遗传力的贡献。
研究背景方面，替代多聚腺苷酸化（alternative polyadenylation，APA）通过选择3′非翻译区（3′ untranslated region，3′ UTR）影响mRNA稳定性、翻译与亚细胞定位。大脑高度分区且神经元依赖树突与突触的局部翻译，使细胞类型分辨率下的APA研究尤为关键。已有研究提示神经退行病中存在异常或隐性3′ UTR使用，但人类大脑缺乏系统性的细胞类型分辨率APA图谱，且3′ UTR选择的遗传控制、3′aQTL如何解释GWAS非编码风险变异仍不清楚。由于表达数量性状位点（expression quantitative trait loci，eQTL）与GWAS变异共定位不足，研究人员需要新的调控层来阐释疾病遗传机制。该论文发表于《Nature Genetics》，正是为填补上述空白而开展。
主要关键技术方法方面，研究人员使用ROSMAP队列中379例死后前额叶皮层样本，采用10x v3化学法的3′端偏向单核RNA测序（single-nucleus RNA-seq，snRNA-seq）覆盖约200万细胞核。研究人员通过识别polyadenylation位点（pA sites）计算远端pA位点使用指数（percentage of distal pA site usage index，PDUI）。遗传分析中将APA与全基因组测序整合，进行细胞类型水平cis 3′aQTL定位，并将3′aQTL与eQTL、蛋白质数量性状位点（protein quantitative trait loci，pQTL）及17个脑性状疾病GWAS做共定位与孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）。功能验证采用SH-SY5Y来源神经元敲低、CRISPR prime editing、核质分数转录本分析、smiFISH等，但按限制不展开试剂与操作细节。
研究结果部分，首先为A single-cell mRNA polyadenylation atlas of human brain。研究人员从7类主要细胞类型识别超过30,000个pA位点，神经元3′ UTR更长、小胶质细胞更短；通过跨个体回归预测反式（trans）APA调控因子，并在SH-SY5Y神经元中敲低PABPN1、PCBP2、U2AF2验证靶基因APA改变；细胞类型间差异APA（differential APA，DAPA）基因为506个，富集于翻译、mRNA运输与生物合成过程，例如CIRBP在神经元几乎完全远端pA、在小胶质细胞近端使用增加。
其次为Differential 3′ UTR choice in AD。研究人员发现AD中无全局3′ UTR长短改变，但兴奋性与抑制性神经元DAPA最多，多数变化发生于晚期AD；DAPA基因与AD差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）重叠很低，效应量不相关，说明APA与表达调控正交；神经元中AD延长APA富集于小胶质细胞激活、微管运输、轴树突运输与线粒体通路，且MAPT、ABCA7、MEF2C等AD风险基因存在DAPA，提示APA通过mRNA稳定性、定位与翻译影响AD。
再次为Genetic regulation of APAs in brain cell types。研究人员鉴定4,288个基因具有遗传调控APA（genetically regulated APAs，g-APAs），兴奋性神经元最多、小胶质细胞最少；lead 3′aQTL富集于3′ UTR、启动子与5′ UTR；与GTEx批量脑3′aQTL方向一致率达97.6%；DHX34与DNAJA1位点经prime editing验证；约70.7% g-APA仅见于单一细胞类型，细胞类型间共享比例37%至59%；结合eCLIP-seq与ChIP-seq预测ZNF148、ZNF460、FAM120A、HNRNPK等调控因子。
随后为3′aQTLs preferentially colocalize with pQTLs over eQTLs。研究人员发现3′aQTL与eQTL基因重叠有限且共定位概率低，说明二者大体正交；3′aQTL与pQTL共定位多于3′aQTL与eQTL，存在3′aQTL-pQTL、3′aQTL-eQTL及三者多共定位模式；3′aQTL-pQTL在3′ UTR与外显子更富集，表明3′ UTR选择更紧密关联蛋白丰度而非单纯mRNA表达。
继而为Identification of 3′aQTL-dependent AD GWAS loci。研究人员通过共定位与MR将AD GWAS位点联系到细胞类型特异性APA机制，全显著位点中4个、亚阈值位点中10个可由3′aQTL解释；PLEKHA1呈3′aQTL-pQTL-GWAS共定位且eQTL独立，APOC2在APOE位点内具小胶质细胞3′aQTL，其lead SNP在条件分析后仍显著且不影响表达，代表APOE与eQTL非依赖的AD风险贡献；SRSF10与SUPT4H1等近端远端异构体在核质与神经元突起定位不同。
最后为Cell-type-specific 3′aQTLs underlying brain traits。研究人员将单细胞3′aQTL用于16至17个脑性状疾病，共解释168个GWAS位点，包括精神分裂症PAK6与AP3B2、双相障碍NDUFA13、帕金森病SNCA等；SNCA的3′ UTR选择改变mRNA定位，体现eQTL非依赖机制。
讨论与结论部分，研究人员总结该工作首次提供人类衰老大脑跨200万细胞、7类主要细胞类型的单细胞APA图谱，并显示APA是不同于表达调控的转录后机制层。细胞类型分辨率3′aQTL揭示3′ UTR选择受cis遗传变异调控，且比eQTL更能通过pQTL解释疾病蛋白层面机制。168个GWAS位点依赖3′aQTL，其中仅少数与eQTL共享，说明大量非编码风险变异可能经APA、mRNA定位与稳定性发挥作用。PLEKHA1、APOC2、SNCA等例子表明，AD与帕金森病风险可不经mRNA表达改变，而经3′ UTR异构体选择与亚细胞定位改变实现。该图谱与3′aQTL资源为脑发育、神经退行病及3′ UTR靶向治疗提供了细胞类型特异性调控基础。
研究结论翻译如下：研究人员提供细胞类型特异性基础，用于探究APA的cis与trans调控，并理解这一关键转录后层对疾病遗传力的贡献；该工作绘制了人类大脑3′ UTR选择的细胞类型分辨率调控图，为开发3′ UTR靶向治疗与研究疾病机制奠定基础。
