《Nature Structural & Molecular Biology》：A phosphoproteome atlas of human cell lines reveals the landscape of kinase activity
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蛋白质磷酸化协调细胞信号传导并控制大多数生物学过程，其失调驱动疾病，尤其是癌症。全面、高通量磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）仍受限于检测灵敏度、数据完整性和计算瓶颈，尤其在低输入（low-input）情境中。在此，研究人员提出一个全面经验
蛋白质磷酸化协调细胞信号传导并控制大多数生物学过程，其失调驱动疾病，尤其是癌症。全面、高通量磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）仍受限于检测灵敏度、数据完整性和计算瓶颈，尤其在低输入（low-input）情境中。在此，研究人员提出一个全面经验性人类磷酸化蛋白质组资源，汇集跨33种多样人类细胞系的超过200,000个I类磷酸化位点（class I phosphosites）。研究人员证明，该谱图库（spectral library）显著改善单次进样磷酸化蛋白质组学（single-shot phosphoproteomics），与无谱图库方法（library-free approaches）相比数据处理速度快30倍，并提高即使微量样本输入下磷酸化位点定位（phosphosite localization）的置信度。整合蛋白质组（proteome）和磷酸化蛋白质组（phosphoproteome）数据，研究人员开发了组合激酶活性评分（combined kinase activity score, Cscore），揭示细胞系特异性和癌症特异性信号脆弱性（signaling vulnerabilities），其中许多与药物敏感性（drug sensitivity）相关。该资源加速深度和可重复的磷酸化蛋白质组学，使细胞信号网络（cellular signaling networks）的系统映射成为可能，并可能通过突出不同细胞状态中可操作的激酶靶点（actionable kinase targets）来赋能精准肿瘤学（precision oncology）。
研究背景与问题：细胞信号由成千上万协调的位点特异性蛋白质磷酸化事件动态调控，决定细胞生长、刺激应答或疾病进程。磷酸化由蛋白激酶催化并由蛋白磷酸酶擦除，是重要翻译后修饰（PTM）。不同细胞类型预期具有不同磷酸化蛋白质组。基于质谱（MS）的磷酸化蛋白质组学已成为同时鉴定和定量磷酸化事件的主要方法，但许多磷酸化事件动态、低化学计量、跨越宽丰度范围，液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）检测困难。历史上定量30,000个磷酸化位点需大量输入和离线分级；现代快速灵敏LC–MS/MS可在单次分析中覆盖类似数量，但磷酸化蛋白质组主要依赖单前体定量和可信定位，缺失值风险高，低输入尤甚。无谱图库数据非依赖性采集（DIA）简化设计并提高覆盖，但现代研究规模、自动化和仪器速度导致搜索和处理海量LC–MS/MS数据成为新瓶颈。为此，研究人员利用窄窗口DIA（nDIA）在33种人源细胞系中研究可检测人磷酸化蛋白质组的范围与调控，构建经验谱图库，计算磷酸化化学计量，并开发组合激酶活性评分（Cscore）识别细胞系特异性信号依赖。该研究发表于《Nature Structural 》。其意义在于加速深度、可重复的磷酸化蛋白质组学，系统映射细胞信号网络，并可能通过突出可操作激酶靶点赋能精准肿瘤学。
主要技术方法：研究人员组装33种人源细胞系，覆盖主要器官、组织、癌细胞与非癌、原代与永生化、悬浮与贴壁、上皮/间充质/内皮/成纤维形态，以及胚胎细胞和诱导多能干细胞（iPS）。细胞在无刺激血清饥饿和血清刺激条件下分析；DLD-1另用pervanadate（PV）处理以增加磷酸酪氨酸（pY）覆盖。样本经蛋白消化后，非富集肽和Ti-IMAC富集磷酸肽用Evosep One LC耦合Orbitrap Astral质谱，以nDIA采集，使用30、100、80和120 SPD梯度。数据用Spectronaut和DIA-NN进行库基与无库搜索；计算位点化学计量；整合iKiP-DB/PTM-SEA、Kinase Library、Rokai和激活位点形成Cscore；并用GDSC和DepMap数据评估药物敏感性与依赖性。样本来源为33种人源细胞系，非患者队列。
研究结果：
Analysis of 33 human cell lines results in exceptionally high coverage of the human proteome and phosphoproteome：研究人员建立细胞系panel和蛋白质组/磷酸化蛋白质组流程，显示可获得人蛋白质组和磷酸化蛋白质组极高覆盖。
Building of the human cell line panel and generation of the proteomics and phosphoproteomics profiles：panel涵盖癌与非癌、不同形态和谱系，并在血清饥饿/刺激下分析；DLD-1加PV；原始文件按细胞系搜索后合并建库，为后续经验谱图库奠定基础。
Deep proteome library covers up to 80% of the canonical human proteome：每文件平均定量9,681个蛋白组，库含543,301个肽前体、364,584个唯一肽序列和16,454个蛋白组，过滤后14,450个。覆盖约80%经典人蛋白质组，中位序列覆盖50%；激酶、磷酸酶、转录因子（TF）、癌基因和肿瘤抑制因子中超过90%被鉴定且中位覆盖>50%，TF略低为35%；覆盖近全部人类激酶组约500种激酶，未见激酶家族偏倚。
Deep phosphopeptide library reveals cell line-specific signaling：磷酸肽富集样本nDIA分析平均每文件鉴定30,446个I类磷酸化位点；库含>500,000个磷酸肽前体、13,891个蛋白组和225,832个不同磷酸化位点。总库中66%为磷酸丝氨酸（pS）、25%为磷酸苏氨酸（pT）、9%为pY；单细胞系过滤后为81.5% pS、15% pT、3.5% pY。细胞系间最大交集为所有细胞系共享的核心信号位点，pY仅1%；多数额外交集为细胞系特异，PV处理DLD-1独特位点中超过三分之二为pY。技术重复间重叠高于细胞系间，指向真实细胞系特异性信号，尤其酪氨酸磷酸化信号。
The dataset shows a high overlap with phosphosites reported in public databases：与PSP、Signor、PTMsigDB、functional score dataset和iKiP-DB比较，超过60%检测位点与MS来源数据库重叠，非MS来源约40%；81,650个位点与functional score dataset重叠，91,523个与PSP重叠。PSP独有位点中超过一半缺乏MS证据且富集pY；位点强度与PSP文献报道数相关。PTMsigDB通路几乎均≥50%覆盖，EGFR通路覆盖386个位点，TGF-β通路7个位点且略低于50%，可能反映TGF-β注释不完整；基因水平两通路覆盖相似，支持通路代表性。
Deep experimental spectral library increases the depth of phosphoproteomes：用未包含于库中的iPS非受控分化异质细胞，六技术重复，四种梯度，比较Spectronaut和DIA-NN库基与无库搜索。库基提高磷酸化蛋白质组深度；Spectronaut在高流条件增加60%、低流增加40%（≥4/6有效值），DIA-NN中位增加但过滤后仅1–2.5%。梯度匹配时增益最大达30%，与保留时间对齐改善有关；跨梯度保留时间相关>0.99。DIA-NN中六个30 SPD文件搜索时间从9 h 55 min降至22 min，平均约30倍，因库前体从46,686,794降至539,880。库基增加主要来自定位良好的位点，directDIA定位局限；独特位点倾向低丰度。
The library provides increased depth in sensitive phosphoproteomics experiments：EGF刺激HeLa，1–20 μg肽，Ti-IMAC富集，80和120 SPD whisper-zoom梯度。库基搜索在所有输入量均更深，平均增加18%；80 SPD梯度10 μg肽饱和，一致定量超过20,000个I类磷酸化位点。directDIA表观完整性更高，但库基检测更多全条件缺失位点，符合EGF刺激；两者均识别经典EGFR激活位点，库基低输入更一致，如EGFR Y1110。结论为经验谱图库增强低输入磷酸化蛋白质组深度和定位置信，并可在无样本特异深度库时快速替代。
Site stoichiometry calculation draws a clear picture of early signaling events on serum stimulation：对31个细胞系计算血清刺激效应，排除SCC-25和PC-3因支原体污染。平均每细胞系1,580个位点，范围474–2,970；总19,378个位点，包括15,443 pS（80%）、3,109 pT（16%）、826 pY（4%）。多数位点化学计量为细胞系特异；化学计量与磷酸肽强度仅弱相关。占有率一般<20%，刺激后升高；磷酸化位点富集碱性motif，精氨酸在?3和?2位，符合AGC家族激酶；去磷酸化富集脯氨酸导向motif，+1位脯氨酸，典型MAPK和CDK靶点。激酶-底物富集显示最激活包括核糖体蛋白激酶、PKB（AKT1/2）和MAPK；最失活包括MARK家族和CDK1/2/4。PSP调控位点中pS占有率最高，pY最低但倍数变化最大，支持pY低基线占有率。该资源为位点占有率和激活事件提供基线。
Cscore calculation allows for kinase activity landscapes across cell lines：功能蛋白质组聚类分出六个谱系相关簇。现有激酶活性推断工具对密切相关的激酶，尤其酪氨酸激酶分辨率不足，出现假阳性：Rokai、PTM-SEA和Kinase Library将EGFR活性分配给无EGFR表达的血癌细胞，未能识别BT-474中ERBB2高活性，也未显示MOLM-13和MV-4-11中FLT3更高活性。研究人员开发Cscore，整合配对全蛋白质组和磷酸化蛋白质组，包括激酶存在证据和三类活性证据：基于体外激酶反应关系及iKiP/PSP的底物磷酸化、基于序列motif的Kinase Library、激酶激活位点定量。成分按相关性加权并计算SKEW因子。计算385种激酶在31个细胞系中的Cscore，改善酪氨酸激酶分辨率，正确赋缺失值并保持方向性，如悬浮细胞EGFR和ERBB2为零，BT-474中ERBB2高；非酪氨酸激酶结果与现有工具一致。
Cscore provides insights into cell sensitivities and therapeutic options：通过Z-score>2异常或≤4细胞系特异定义，获得210个激酶-细胞系关联，并与GDSC药物敏感性AUC比较。多个关联匹配已知：NB1高ALK活性对ALK抑制敏感，FLT3活跃的MOLM-13和MV-4-11对FLT3抑制剂敏感，MV-4-11对FAK/FGFR、ML-1对PAK1、SU-DHL-4对Src/SYK抑制敏感。BT-474中ERBB2和ERBB4高活性，对Afatinib敏感，对CI-1033更敏感，选择性ERBB2抑制提高特异性；MAPK通路抑制剂在U-2 OS和RD中强效。部分关系复杂：OCI-M1高NTRK1但NTRK抑制剂在其他细胞更有效，CDK6预测未验证，广谱CDK影响多细胞，特异CDK4/6有限。DepMap显示核心生存激酶PLK1、WEE1和CDK1依赖，并验证ALK、FLT3、ERBB2、SYK等细胞系特异脆弱性。支持选择性抑制剂验证Cscore预测，另发现MIA PaCa-2中EPHA3/EPHA4和HepG2中ERN1等潜在靶点但未验证。
讨论部分：研究人员生成33种人源细胞系深度蛋白质组和磷酸化蛋白质组图谱，每细胞系平均约9,700个蛋白组和约30,000个I类磷酸化位点，构成独特社区资源，可直接作为高质量实验谱图库。蛋白质组库含>16,000个蛋白组，中位序列覆盖50%，基于单次LC–MS/MS，剩余未覆盖部分可能反映采集深度、实验设计或不可检测区域，也缺少未纳入细胞类型特异蛋白。磷酸化蛋白质组检测>225,000个唯一位点，>109,827个一致可信定量，约90,000个与PSP重叠，包括无MS证据位点。通路覆盖高，且包含癌与非癌细胞系，便于比较信号状态。但磷酸化事件组织/背景特异，未纳入组织、非经典蛋白质组或需特定激活的位点不可检测；磷酸化蛋白质组FDR估计仍困难。经验谱图库在Spectronaut和DIA-NN中优于无库方法；DIA-NN通过缩小初始搜索空间获得鉴定略增和约30倍处理时间降低，Spectronaut directDIA深度依赖输入文件质量和数量，库基提高鉴定但未减少时间。低输入实验平均增加18%，directDIA表观完整性可能因噪声整合或阈值不优，库提供高质量参考谱。化学计量提供直接生物学度量，但受数据稀疏和测量精度限制，每个值积累四个强度测量误差，低占有率位点难精确计算。Cscore整合多维证据，计算385种激酶在31个细胞系，并与药物敏感性关联，验证若干细胞系-激酶脆弱性，但许多组合不可成药、缺乏选择性抑制剂或未在GDSC中。总体，该资源可作为高质量实验谱图库，支持数据探索和挖掘，指导靶向MS分析方法开发，为药物敏感性研究提供信息，并帮助识别新的治疗脆弱性。研究结论翻译：总体而言，研究人员提供了一个多功能资源，可作为高质量实验谱图库，支持数据探索和挖掘，指导靶向质谱分析方法开发，为药物敏感性研究提供信息，并帮助识别新的治疗脆弱性。
