低聚木糖膳食补充对西方蜜蜂肠道菌群调节作用的有限性研究

《Microorganisms》：Limited Microbiota-Modulating Effects of Dietary Xylo-Oligosaccharide Supplementation in Apis mellifera

　　

： 益生元被广泛用于调节肠道微生物群落，但其对蜜蜂肠道菌群的影响仍知之甚少。低聚木糖（XOS）在人类和畜禽中被认为是潜在的益生元底物，但其在蜜蜂体内的作用鲜有研究。本研究评估了膳食XOS补充对西方蜜蜂（Apis mellifera）肠道菌群的影响。研究人员采用基于加标（spike-in）的绝对定量16S rRNA基因测序技术，对总细菌载量及五个核心菌群（Lactobacillus Firm-5、Bombilactobacillus、Bifidobacterium、Gilliamella和Snodgrassella alvi）的绝对和相对丰度进行了定量。进一步通过α多样性指数和β多样性分析评估了微生物多样性和群落结构。XOS补充未显著影响总细菌丰度或五个核心菌群的丰度（p > 0.05）。α多样性未检测到显著差异（p > 0.05），基于未加权和加权UniFrac分析，对照组和XOS组的群落结构 largely 重叠。然而，PICRUSt2分析识别出两组之间若干预测微生物功能通路存在差异（p < 0.05）。这些结果表明，在测试条件下，膳食XOS补充对已建立的西方蜜蜂肠道菌群的丰度、多样性和结构仅有有限的可检测影响，尽管观察到其预测功能潜力的变化。研究人员的发现提示，益生元在蜜蜂中的功效可能取决于宿主特异的微生物生态学，哺乳动物系统中观察到的益生元反应可能无法直接适用于蜜蜂。这些结果强调了在商业益生元产品广泛应用之前，使用蜜蜂特异性体内证据验证其功效的重要性。

论文解读文章：

一、研究背景与科学问题

益生元是指能被宿主相关微生物选择性利用并从而可能改善宿主健康的底物，多为抵抗宿主酶消化的非消化性碳水化合物，可被肠道菌群中特定成员代谢，进而影响微生物生长、群落组成及发酵代谢产物的生成。人类和畜禽中常见的益生元包括菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖和低聚木糖（XOS）等。在用于食品、饲料及其他商业用途的大规模饲养昆虫中，通过益生菌或益生元途径调控肠道菌群被提议作为改善昆虫生长、营养利用、健康及抗病能力的策略，但相关证据远少于脊椎动物。

肠道菌群在蜜蜂的营养、发育、免疫和整体健康中发挥重要作用。与许多脊椎动物复杂的肠道群落相比，成年蜜蜂的肠道菌群相对简单，由少数宿主相关细菌谱系主导，包括Lactobacillus Firm-5、Bombilactobacillus、Gilliamella、Bifidobacterium和Snodgrassella。这些细菌在健康工蜂中稳定存在，在回肠和直肠中形成稳定的微生物群落。蜜蜂肠道菌群组成受限且与宿主紧密关联，使其成为研究饮食、肠道细菌与宿主生理相互作用的良好模型。

尽管益生元在人类和其他动物中的效应已被充分证实，其在蜜蜂中的应用受到的关注相对有限。现有研究主要聚焦于对宿主存活和病原抗性的影响，特别是缓解蜜蜂微孢子虫病的潜力。然而，有研究报告膳食微生物干预未能预防微孢子虫病，部分处理还与免疫稳态破坏和死亡率增加相关。体外研究中，利用中华蜜蜂（Apis cerana）肠道菌群建立的发酵体系中，菊粉、低聚果糖、低聚木糖和异麦芽低聚糖对细菌生长和产酸表现出不同效应。一项体内研究评估了菊粉在西方蜜蜂中的补充效果，但未检测到益生元效应。因此，单一益生元对蜜蜂肠道菌群丰度、多样性和群落结构影响的直接证据仍然有限。

XOS是由β-1,4键连接的木糖单元组成的短链低聚糖，通常从富含木聚糖的植物材料中生产。XOS能抵抗宿主酶消化，到达下肠道并被特定肠道菌群利用。人类和畜禽研究显示XOS补充可促进有益菌尤其是Bifidobacterium，并改变微生物发酵和代谢产物。然而，不同细菌物种和菌株利用XOS的能力存在差异，其效应可能取决于常驻菌群组成和实验条件。尽管XOS已纳入中华蜜蜂肠道菌群体外研究，其在体内对蜜蜂肠道菌群丰度和群落结构的影响仍不清楚。本研究旨在评估膳食XOS补充对西方蜜蜂肠道菌群的影响，考察细菌丰度、α多样性和群落结构，以确定XOS是否能在体内调节蜜蜂肠道菌群。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员在扬州大学实验蜂场维持三群健康的西方蜜蜂蜂群。XOS溶解于50%（w/v）蔗糖溶液中至终浓度1%（w/v），对照组使用不含XOS的相同蔗糖溶液。实验前18天将每群蜂王限制在单个巢脾上以获得同步化的新羽化工蜂群体。带蛹巢脾转移至实验室，在35°C和90%相对湿度下孵育。从封盖巢房中无菌取出暗眼晚期蛹，单独置于无菌24孔组织培养板中直至羽化。24小时内羽化的活跃工蜂收集后置于无菌饲养笼中，每笼20只，每个处理设三个重复笼。

微生物接种物制备自相同三群蜂群的供体蜂。每群选择三只肠道明显充盈的哺育蜂，无菌解剖后合并肠道并用无菌研杵匀浆，悬浮于800 μL无菌磷酸盐缓冲液中，低速离心15秒去除大碎片，上清液作为微生物接种物。接种物按每1 g饲料100 μL的比例掺入花粉饼中，对照组和XOS组均提供相同的接种花粉饼。对照组给予50%蔗糖溶液，XOS组给予含1% XOS的50%蔗糖溶液。蜜蜂在30°C、60%相对湿度、持续黑暗的恒温培养箱中饲养，每日移除死蜂。

选择7天饲喂期是因为成年蜜蜂特征性肠道菌群通常在羽化后约6–7天内建立。饲喂期结束后，每笼随机选取5只蜜蜂，每处理共15只。蜜蜂经CO₂麻醉、75%乙醇表面消毒、无菌蒸馏水冲洗三次后，无菌解剖全肠道，液氮速冻，?80°C保存至DNA提取。每个处理全部15个个体肠道样本用于细菌定量和16S rRNA基因测序。

主要技术方法包括：使用FastDNA SPIN Kit提取基因组DNA；采用基于加标（spike-in）的绝对定量16S rRNA基因测序，合成加标序列保留保守细菌引物结合区域但含人工可变区，九个覆盖预设浓度范围的加标标准品在扩增前加入每个DNA样本；细菌16S rRNA基因V3–V4区和加标标准品使用引物341F和805R共扩增，在Illumina NovaSeq 6000平台进行2 × 250 bp双端测序。序列数据在QIIME 2中处理，使用Cutadapt去除引物和接头，DADA2进行质量过滤、去噪、合并和嵌合体检查。扩增子序列变异（ASV）使用基于蜜蜂肠道菌群参考数据库训练的朴素贝叶斯分类器进行分类学分配，置信阈值80%。α多样性采用Observed、Chao1、ACE、Shannon、Simpson和Pielou均匀度指数评估；群落结构差异使用未加权和加权UniFrac距离评估，通过非度量多维尺度分析（NMDS）可视化，并以置换多元方差分析（PERMANOVA）检验。微生物功能谱使用PICRUSt2从16S rRNA基因测序数据预测。统计分析使用线性混合效应模型（LMM），处理为固定效应、笼身份为随机效应，使用lmer(Response ~ Treatment + (1|Cage))模型；差异显著性以p < 0.05为标准。

三、研究结果

3.1 XOS补充未产生可检测的主要肠道细菌丰度变化

总细菌载量和五个核心菌群合并丰度在对照组和XOS组之间相似（p > 0.05）。两组肠道菌群主要由Lactobacillus Firm-5、Bifidobacterium、Snodgrassella alvi、Bombilactobacillus和Gilliamella组成，整体群落谱系在处理间无明显分离。对单个菌群的分析进一步显示，XOS补充未显著影响Lactobacillus Firm-5、Bombilactobacillus、Bifidobacterium、Gilliamella或S. alvi的绝对丰度（p > 0.05）。Gilliamella在个体间变异较大，但该变异在两组中均存在，未形成一致的处理相关模式。相对丰度结果类似，五个核心菌群在两组间均未检测到显著差异（p > 0.05）。

3.2 XOS补充未产生可检测的蜜蜂肠道菌群α多样性变化

六个α多样性指数在两组间比较。丰富度相关指数Observed、Chao1和ACE在两组间分布相似，未检测到显著差异（p > 0.05）。XOS组中少数个体表现出相对较高的丰富度值，但中位数仍接近对照组。反映分类群丰富度和丰度分布的Shannon和Simpson指数在两组间也无显著差异（p > 0.05）。Pielou均匀度在处理间无显著差异，尽管XOS组中位数略低且变异更大。

3.3 XOS补充未产生可检测的肠道菌群整体群落结构变化

基于未加权UniFrac距离的NMDS图中，对照组和XOS组样本 largely 混合，两个置信椭圆广泛重叠。PERMANOVA分析显示处理仅解释了群落组成变异的很小比例，组间差异不显著（R2 = 0.018，p = 0.630）。加权UniFrac距离的NMDS分析呈现类似模式，两组样本再次 substantial 重叠，未观察到清晰的处理依赖性聚类。PERMANOVA确认相对丰度加权的群落结构在两组间无显著差异（R2 = 0.023，p = 0.689）。

3.4 XOS补充影响了若干预测微生物功能

PICRUSt2功能预测识别出两组间存在差异的若干通路。与对照组相比，XOS组中糖胺聚糖生物合成、青霉素和头孢菌素生物合成、视黄醇代谢和志贺菌病相关通路预测丰度较高，而脂肪酸生物合成和硝基甲苯降解预测丰度较低（p < 0.05）。

四、讨论与结论

XOS在人类中常作为益生元调节肠道菌群，但本研究中XOS未引起蜜蜂肠道菌群整体丰度、多样性或群落结构的可检测变化。这一结果不同于XOS在人类和畜禽中常报道的双歧杆菌增殖效应。蜜蜂肠道菌群由少数高度特化的细菌谱系组成，人类和畜禽系统中的益生元效应不能直接外推至蜜蜂。此前基于蜜蜂肠道菌群的体外发酵研究显示不同低聚糖产生不同效应，而菊粉体内研究也未检测到明确益生元效应，表明特定益生元的响应在不同宿主物种和实验系统间可能差异显著。

缺乏明确响应的可能解释是蜜蜂主要肠道细菌利用XOS的能力有限。低聚糖的益生元效应取决于常驻菌群的代谢能力，包括合适的转运系统和碳水化合物降解酶的存在。蜜蜂相关Bifidobacterium及其他核心菌群谱系与哺乳动物相关双歧杆菌在代谢该底物的能力上可能存在差异。膳食环境也可能影响响应，蜜蜂摄入的易利用糖类和花粉来源碳水化合物可能被肠道细菌优先利用，这些替代碳源的可用性加上菌群在回肠和直肠的空间组织，可能降低XOS提供的选择性优势。然而，由于仅评估了一个XOS浓度和一个采样时间点，不能排除剂量或时间依赖性效应；重复笼数量较少也可能限制了检测细微处理效应的统计功效。

本体内研究显示膳食XOS补充对西方蜜蜂肠道菌群的丰度、多样性和群落结构仅有有限的可检测影响。但PICRUSt2分析表明若干预测微生物功能通路存在差异，提示XOS可能影响肠道菌群的功能潜力，即使未伴随明显的分类学变化。这些差异应谨慎解读，因其是从16S rRNA基因数据推断而非直接测量的微生物功能，需通过宏基因组或代谢组方法进一步验证。

研究结论：本体内研究表明，在测试条件下，膳食XOS补充对西方蜜蜂肠道菌群的丰度、多样性和群落结构仅有有限的可检测影响。这些发现表明XOS在测试条件下调节西方蜜蜂肠道细菌群落的能力有限。但不能排除对微生物活性的可能影响，需进一步研究微生物代谢和宿主生理的变化。鉴于商业益生元产品在蜜蜂中的日益普及，此类产品的功效应在广泛应用前获得宿主特异性体内证据的支持。