《Microorganisms》：Isolation and Genome-Resolved Characterisation of Selected Indigenous Lactic Acid Bacteria from Traditional Fermented Dairy Products of Kazakhstan
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传统发酵乳制品构成了稳定、自组织的微生物生态系统，其形成依赖于自然发酵过程以及微生物与原料、环境条件和当地加工实践之间的长期协同进化。与采用标准化发酵剂生产的工业产品不同，此类系统具有高度的微生物变异性、复杂的微生物互作关系，以及适应特定生态位的本土菌株的存在
传统发酵乳制品构成了稳定、自组织的微生物生态系统，其形成依赖于自然发酵过程以及微生物与原料、环境条件和当地加工实践之间的长期协同进化。与采用标准化发酵剂生产的工业产品不同，此类系统具有高度的微生物变异性、复杂的微生物互作关系，以及适应特定生态位的本土菌株的存在。近年来，发酵食品系统因其营养、技术和功能重要性而受到广泛关注。乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）被视为发酵乳生态系统中的关键功能组分，其在乳糖发酵、酸化、风味形成以及有机酸、香气化合物和抗微生物代谢产物的产生中发挥重要作用。此外，某些LAB物种具有益生特性，可能通过调节肠道菌群对人类健康产生贡献。尽管发酵食品微生物组研究已取得显著进展，但多数研究依赖于16S rRNA基因扩增子测序或宏基因组分析，这些方法虽能提供微生物群落组成的有价值信息，却无法实现活体微生物的分离或其基因组与功能特性的直接评估。因此，许多具有潜在价值的菌株在培养和基因组层面仍未得到充分表征。基于培养的方法（包括培养组学策略）结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS），能够克服上述局限性，既可实现纯培养物的分离，又可进行高精度的分类学和功能表征。然而，此类整合方法在中亚传统乳制品中的应用仍极为有限。在哈萨克斯坦的传统发酵乳制品中，马奶酒（kumis）和双峰驼奶酒（shubat）尤为值得关注。马奶酒是以马乳为原料，经乳酸发酵和酒精发酵混合过程制成的发酵饮品，涉及LAB和酵母菌。骆驼奶酒以骆驼乳为原料，主要以乳酸发酵为特征，其酸度、黏度和固形物含量均高于马奶酒。两种产品均采用传统回添法（back-slopping）制备，即取上一批次已发酵产品的一部分作为新鲜乳的发酵剂。因此，其微生物群通过反复的微生物演替和对当地环境条件的适应而发展。已有研究报道，马奶酒和骆驼奶酒的微生物群以乳球菌属（Lactococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、慢乳杆菌属（Lentilactobacillus）、链球菌属（Streptococcus）及多种酵母菌为主，尽管这些微生物的相对丰度因地理位置、季节、发酵实践和原料乳组成而异。这些特性使哈萨克斯坦传统发酵乳制品成为本土微生物多样性的宝贵资源库。传统发酵食品研究面临的另一挑战是商业微生物鉴定系统的适用性有限。尽管MALDI-TOF MS已成为快速细菌鉴定的广泛使用工具，但不完整的参考数据库在分析传统食品生态系统中的本土微生物时经常降低其准确性。同样，16S rRNA基因测序可能无法为近缘种的区分提供足够分辨率，特别是在明串珠菌属等分类学复杂的类群中，从而限制了分类学精度。在此背景下，全基因组测序的应用尤为重要，它不仅能够阐明分离株的分类学地位，还能评估其基因组特征、潜在代谢能力和进化关系。然而，从哈萨克斯坦传统乳制品中分离的可培养LAB的基因组数据仍然匮乏，这对理解区域微生物多样性及其潜在应用造成了显著空白。因此，需要开展整合培养依赖性分离、MALDI-TOF MS、16S rRNA基因测序、系统发育分析和WGS的综合研究，以增进对传统发酵乳制品相关本土LAB的理解。此类研究对于鉴定具有潜在技术价值的本土菌株以及开发区域适应性发酵剂和功能性发酵食品至关重要。据此，本研究旨在采用多阶段方法，结合培养依赖性方法、MALDI-TOF MS、16S rRNA基因测序、系统发育分析及选定本土菌株的全基因组测序，全面表征从哈萨克斯坦传统乳制品中分离的乳酸菌的可培养多样性。
一、研究背景与科学问题
传统发酵乳制品是稳定且自组织的微生物生态系统，其形成依赖于自然发酵过程以及微生物与原料、环境条件和当地加工实践之间的长期协同进化。与采用标准化发酵剂生产的工业产品不同，此类系统具有高度的微生物变异性、复杂的微生物互作关系，以及适应特定生态位的本土菌株的存在。乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）被视为发酵乳生态系统中的关键功能组分，其在乳糖发酵、酸化、风味形成以及有机酸、香气化合物和抗微生物代谢产物的产生中发挥重要作用。此外，某些LAB物种具有益生特性，可能通过调节肠道菌群对人类健康产生贡献。
然而，当前发酵食品微生物组研究多依赖16S rRNA基因扩增子测序或宏基因组分析，这些方法虽能提供微生物群落组成信息，却无法实现活体微生物的分离及其基因组与功能特性的直接评估。培养依赖性方法结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS），能够克服上述局限性，但此类整合方法在中亚传统乳制品中的应用仍极为有限。哈萨克斯坦的传统发酵乳制品——马奶酒（kumis）和骆驼奶酒（shubat）——具有独特的微生物生态特征，其微生物群以乳球菌属（Lactococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、慢乳杆菌属（Lentilactobacillus）、链球菌属（Streptococcus）及多种酵母菌为主。然而，商业微生物鉴定系统对这些本土微生物的鉴定准确性有限，16S rRNA基因测序在近缘种区分方面分辨率不足，且该地区可培养LAB的基因组数据仍然匮乏。因此，亟需开展整合多种方法的综合研究，以全面表征哈萨克斯坦传统乳制品中本土LAB的可培养多样性。
二、研究内容与结论
本研究共采集哈萨克斯坦突厥斯坦地区102份样品，包括31份马奶酒、16份骆驼奶酒、20份生马乳、28份生骆驼乳和7份新鲜骆驼乳软奶酪。研究人员通过培养依赖性工作流程，从样品中初步获得315株细菌分离物，经MALDI-TOF MS和16S rRNA基因测序鉴定后，最终确认79株为LAB，归属于4个属8个物种。其中，肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）为优势物种，占60.8%（48/79），其次是乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），占24.1%（19/79）。希氏慢乳杆菌（Lentilactobacillus hilgardii）、开菲尔慢乳杆菌（Lentilactobacillus kefiri）和二醇慢乳杆菌（Lentilactobacillus diolivorans）仅在发酵产品来源的分离株中检出，副干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）则以较低频率检出。研究人员进一步选取5株代表性分离株进行WGS，获得1.68至2.69 Mb的基因组草图和34.8%至43.1%的GC含量。OrthoANI分析支持物种水平的分类学归属，并为选定分离株提供了亚种水平的分辨率。该研究建立了哈萨克斯坦传统乳制品本土LAB的培养物保藏库，为后续比较基因组学、生理学和技术研究奠定了基础。
三、关键技术与方法
研究人员采用多阶段整合方法：首先在MRS琼脂培养基上对有氧条件下30°C培养48小时，采用随机扇区菌落收集策略以最小化选择偏差；随后利用MALDI-TOF MS进行快速初步鉴定；对16S rRNA基因进行聚合酶链式反应（PCR）扩增和Sanger测序，并通过BLAST比对和邻接法（Neighbour-Joining）系统发育分析确认分类学地位；最后选取5株代表性菌株在Illumina MiSeq平台（2×300 bp）进行全基因组测序，使用SPAdes v3.15.5进行从头组装，通过QUAST v5.2.0评估组装质量，并以OrthoANI分析进行基因组水平的分类学确认。
四、研究结果
3.1 LAB分离株的分离与分类学鉴定
研究人员从102份样品中初步获得315株具有LAB典型菌落形态的细菌分离物，其中124株经MALDI-TOF MS和16S rRNA基因测序进行鉴定，最终79株被确认为LAB。16S rRNA基因测序鉴定出4个属8个物种：肠膜明串珠菌为优势种（60.8%），其次为乳酸乳球菌（24.1%），其余物种包括乳酸明串珠菌（Leuconostoc lactis，5.1%）、开菲尔慢乳杆菌（2.5%）、希氏慢乳杆菌（2.5%）、副干酪乳杆菌（2.5%）、法尔肯贝格明串珠菌（Leuconostoc falkenbergense，1.3%）和二醇慢乳杆菌（1.3%）。不同乳制品的LAB群落组成存在差异：马奶酒产出的LAB分离株数量最多（37株）且物种多样性最高；生骆驼乳含16株，代表5个物种；生马乳13株；骆驼乳奶酪8株；骆驼奶酒5株。肠膜明串珠菌在所有产品类型中均有检出，在发酵乳制品中尤为优势；乳酸乳球菌在生骆驼乳中相对丰度较高。
3.2 分离株的系统发育分析（16S rRNA）
基于部分16S rRNA基因序列的邻接法系统发育分析支持了代表性LAB分离株的分类学归属。系统发育分析将分离株分为4个属，即明串珠菌属、乳球菌属、慢乳杆菌属和乳酪杆菌属（Lacticaseibacillus），与序列分析获得的分类学归属一致。在明串珠菌属系统发育树中，多数分离株与肠膜明串珠菌参考菌株聚类，而分离株LPG-L-174、LPG-L-199、LPG-L-235和LPG-L-264与乳酸明串珠菌形成独立簇，LPG-L-290与法尔肯贝格明串珠菌聚类。乳球菌属系统发育树显示，所有代表性乳酸乳球菌分离株与对应参考菌株形成高支持率的单系簇。慢乳杆菌属系统发育树将代表性分离株分为开菲尔慢乳杆菌、希氏慢乳杆菌和二醇慢乳杆菌3个物种水平簇。乳酪杆菌属系统发育树中，LPG-L-207和LPG-L-305与副干酪乳杆菌参考菌株聚类。
3.3 全基因组测序与基因组特征
研究人员选取5株代表性分离株进行WGS：LPG-L-32（乳酸乳球菌）、LPG-L-123（肠膜明串珠菌）、LPG-L-148（开菲尔慢乳杆菌）、LPG-L-174（乳酸明串珠菌）和LPG-L-290（法尔肯贝格明串珠菌）。Illumina MiSeq测序每株产生127万至187万条读段，平均读长262至290 bp。从头组装获得1.68至2.69 Mb的草图基因组，其中乳酸明串珠菌LPG-L-174基因组最小（1.68 Mb），乳酸乳球菌LPG-L-32基因组最大（2.69 Mb），其余基因组介于2.02至2.59 Mb之间。基于NCBI RefSeq数据库的BLAST比对将所有5株分离株鉴定至物种水平：LPG-L-32归属于乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis），LPG-L-123归属于肠膜明串珠菌肠膜亚种（Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides）。OrthoANI分析进一步支持这些归属，各分离株与同种参考基因组显示出最高相似性，数值介于97.13%至99.47%之间。
五、讨论与结论
讨论部分指出，315株初始分离物中仅79株被确认为LAB，凸显了培养依赖性方法在初步回收和分类学表征方面的局限性。MALDI-TOF MS和16S rRNA基因测序提供了互补的分类学信息，但各有局限：MALDI-TOF MS受参考数据库不完整影响，16S rRNA基因测序在近缘种区分方面分辨率有限。肠膜明串珠菌的高频检出与其异型发酵特性、广泛的碳水化合物利用能力和胞外多糖产生能力相关，但应被解释为可培养LAB组分的特征而非其在整体微生物群中的优势证据。乳酸乳球菌在生骆驼乳中的相对高丰度可能与骆驼乳的理化特性及天然抗菌组分有关。马奶酒中较高的LAB多样性可能归因于马乳的高乳糖含量和传统回添法制备工艺。骆驼奶酒中较低的可培养LAB多样性可能与骆驼乳的天然抗菌特性相关。法尔肯贝格明串珠菌的检出因其近期才被描述且报道稀少而具有特殊的生态学意义。WGS为5株代表性分离株提供了基因组水平的分类学确认，并实现了亚种水平的分辨率。
研究结论：本研究采用培养依赖性工作流程，结合MALDI-TOF MS、部分16S rRNA基因测序、系统发育分析和全基因组测序，表征了哈萨克斯坦突厥斯坦地区传统乳制品和原料乳中可培养的乳酸菌。在最初获得的315株细菌分离物中，79株被确认为LAB，归属于4个属8个物种：明串珠菌属、乳球菌属、慢乳杆菌属和乳酪杆菌属。肠膜明串珠菌是最常回收的物种，占确认LAB分离株的60.8%，其次是乳酸乳球菌（24.1%）。不同产品类型中回收的LAB组成存在差异，肠膜明串珠菌在马奶酒和其他被调查产品中频繁回收，而乳酸乳球菌在生骆驼乳来源的LAB分离株中占相当比例。较少回收物种的检出，包括法尔肯贝格明串珠菌、开菲尔慢乳杆菌、希氏慢乳杆菌、二醇慢乳杆菌和副干酪乳杆菌，证明了从被调查产品中回收的可培养LAB组分的分类学多样性。5株代表性分离株的全基因组测序为其分类学归属提供了基因组水平的支持，获得1.68至2.69 Mb的草图基因组，GC含量为34.79%至43.07%。OrthoANI值97.13%至99.47%支持相应的物种归属，而基因组水平分析为选定分离株实现了亚种水平的分辨率，包括乳酸乳球菌乳酸亚种和肠膜明串珠菌肠膜亚种。总体而言，本研究建立了从突厥斯坦地区原料乳和传统乳制品中回收的本土LAB培养物保藏库，并为选定代表菌株提供了基因组序列。所获得的分离株和基因组资源为后续比较基因组学、生理学和技术研究奠定了基础。需要进一步的实验表征来确定各分离株的功能和技术特性，并评估其作为潜在发酵剂或其他应用的适宜性。
