《Frontiers in Microbiology》：Structural and functional characterization of the gut microbiota in women with early pregnancy loss in Northwest China
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背景： 早期妊娠丢失（EPL）是一种常见的不良妊娠结局，其病因复杂且尚未完全阐明。此外，针对中国西北地区EPL女性肠道菌群的宏基因组学研究仍然有限。目的： 本研究旨在利用鸟枪法宏基因组测序（shotgun metagenomic sequencing），表征E
背景： 早期妊娠丢失（EPL）是一种常见的不良妊娠结局，其病因复杂且尚未完全阐明。此外，针对中国西北地区EPL女性肠道菌群的宏基因组学研究仍然有限。目的： 本研究旨在利用鸟枪法宏基因组测序（shotgun metagenomic sequencing），表征EPL组与正常对照组（NCs）之间肠道微生物组成和预测功能的差异。方法： 研究人员收集了中国西北地区216名女性（EPL组，n=72；NCs，n=144）的粪便样本。采用鸟枪法宏基因组测序分析肠道菌群组成并评估菌群的潜在功能。结果： 通过α多样性和β多样性分析，研究发现EPL组与NCs之间的肠道菌群组成存在显著差异（p<0.001）。EPL组中拟杆菌属（Bacteroides）的相对丰度显著更高，而NCs中粪球菌属（Coprococcus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和罗斯氏菌属（Roseburia）的相对丰度显著更高。与NCs相比，EPL组中如粪便拟杆菌（Bacteroides stercoris）、普通拟杆菌（Bacteroides plebeius）和单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）等物种的相对丰度较高，而青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）、绳状巨单胞菌（Megamonas funiformis）和Fusicatenibacter saccharivorans的相对丰度较低。偏相关分析显示，在门水平上，拟杆菌门（Bacteroidetes）与EPL呈正相关。在属水平上，臭杆菌属（Odoribacter）、副拟杆菌属（Parabacteroides）和嗜血杆菌属（Haemophilus）与EPL呈正相关，而棒状杆菌属（Corynebacterium）、乳杆菌属（Lactobacillus）和罗斯氏菌属（Roseburia）与EPL呈负相关。代谢通路分析揭示，L-鼠李糖降解I、L-精氨酸生物合成III和2-氧代丁酸降解I等通路与EPL呈显著正相关。相反，嘌呤核苷碱基降解I（厌氧）和几丁质衍生物降解等通路与EPL呈显著负相关。结论： 研究结果揭示了EPL组与NCs之间在肠道菌群组成和代谢通路上存在显著差异，表明肠道微生物组的改变与EPL相关。
研究背景与科学问题
早期妊娠丢失（Early Pregnancy Loss, EPL）是指在妊娠早期发生的自然流产，全球范围内影响约15%-20%的临床确认妊娠，每年约有2300万例流产发生。EPL的病因复杂，涉及遗传、内分泌、代谢和免疫等多种因素，如甲状腺疾病、糖尿病以及系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病。近年来，肠道微生物组在宿主健康中的作用受到广泛关注。研究表明，肠道菌群参与调节宿主的免疫、内分泌和代谢功能，其生态失衡与多种胃肠道、心血管及呼吸系统疾病相关。此外，肠道菌群可能通过调节宿主代谢和免疫，影响女性生殖健康，并与子宫内膜异位症或多囊卵巢综合征等EPL高风险人群的菌群特征存在差异。然而，目前关于肠道菌群与EPL关系的研究仍十分有限，且现有研究普遍存在样本量小、测序分辨率低等问题。因此，有必要在中国西北地区开展基于宏基因组测序的高分辨率研究，以探索EPL患者肠道菌群的差异变化，为识别与EPL相关的微生物标志物提供基础。
研究方法概述
本研究于2022年1月至2023年12月期间，从中国西北高原城市兰州招募了216名参与者，包括72名EPL女性和144名正常对照（Normal Controls, NCs）。研究人员采用标准化的病例-对照设计（1:2比例）以增强统计效力。所有参与者均排除了近2个月内使用抗生素或近1个月内使用益生菌者。研究人员收集粪便样本后，交由北京MyGenostics公司进行鸟枪法宏基因组测序（Shotgun metagenomic sequencing），在Illumina NovaSeq 6000平台上进行双端150 bp测序。测序数据经MOCAT v2.0进行质量控制、组装，并使用Bowtie2 v2.5.4比对至MicroNR数据库进行物种注释。功能谱分析采用HMP统一代谢分析网络（HUMAnN v3.0）将基因家族映射至MetaCyc数据库中的代谢通路。统计分析方面，研究人员使用Wilcoxon秩和检验比较组间微生物相对丰度差异，并通过偏Spearman相关分析控制教育水平、年龄和腰臀比（Waist-to-Hip Ratio, WHR）等混杂因素，同时采用Benjamini-Hochberg方法进行多重检验校正。
研究结果
3.1 微生物多样性与差异分类丰度
基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（Principal Coordinate Analysis, PCoA）显示，EPL组与NCs在属水平和种水平的肠道菌群组成上存在显著分离（属水平R2=0.087，p<0.001；种水平R2=0.047，p<0.001）。α多样性分析表明，EPL组的Shannon、Simpson和逆Simpson指数均显著低于NCs（p<0.01），提示EPL组肠道菌群多样性降低。在门水平上，EPL组粪便菌群以变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）为主，而NCs则以放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门和厚壁菌门为主。EPL组中厚壁菌门和放线菌门的相对丰度显著降低，而拟杆菌门的相对丰度显著升高（p<0.001）。在属水平上，NCs中粪球菌属（Coprococcus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、罗斯氏菌属（Roseburia）、未分类的毛螺菌科（unclassified Lachnospiraceae）、柯林斯菌属（Collinsella）、多尔氏菌属（Dorea）、Fusicatenibacter、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、布劳特氏菌属（Blautia）和巨单胞菌属（Megamonas）的相对丰度显著更高，而EPL组中拟杆菌属（Bacteroides）的相对丰度显著更高。在种水平上，NCs中青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）、绳状巨单胞菌（Megamonas funiformis）、Fusicatenibacter saccharivorans、Coprococcus eutactus、Ruminococcus bromii和Eubacterium rectale的相对丰度更高，而EPL组中粪便拟杆菌（Bacteroides stercoris）、普通拟杆菌（Bacteroides plebeius）、单形拟杆菌（Bacteroides uniformis）和Bacteroides vulgatus的相对丰度更高。
3.2 EPL相关微生物类群的偏相关分析
在控制教育水平、年龄和WHR后，偏Spearman相关分析显示：在属水平，拟杆菌属（Bacteroides）、臭杆菌属（Odoribacter）、副拟杆菌属（Parabacteroides）和嗜血杆菌属（Haemophilus）与EPL呈正相关；而棒状杆菌属（Corynebacterium）、乳杆菌属（Lactobacillus）、罗斯氏菌属（Roseburia）、Agathobaculum、放线菌属（Actinomyces）、Mogibacterium、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、Fusicatenibacter、粪球菌属（Coprococcus）、Gemmiger、布劳特氏菌属（Blautia）、多尔氏菌属（Dorea）、巨单胞菌属（Megamonas）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和柯林斯菌属（Collinsella）与EPL呈负相关。其中，拟杆菌属的正相关性最强，柯林斯菌属的负相关性最强。在种水平，普通拟杆菌（Bacteroides plebeius）与EPL的正相关性最强，而Collinsella stercoris的负相关性最强。
3.3 EPL相关肠道菌群功能能力的鉴定
代谢通路分析发现，共有40条通路在EPL组中显著富集。与EPL呈最强正相关的10条通路包括：L-鼠李糖降解I、L-精氨酸生物合成III（通过N-乙酰-L-瓜氨酸）、2-氧代丁酸降解I、硫胺素二磷酸补救II、L-组氨酸降解I、L-组氨酸降解III、吡哆醛5'-磷酸生物合成I、脂质IVA生物合成（P. putida）、脂质IVA生物合成（E. coli）以及吡哆醛5'-磷酸生物合成与补救超通路。而与EPL呈负相关的通路包括：嘌呤核苷碱基降解I（厌氧）、几丁质衍生物降解、水苏糖降解、L-精氨酸生物合成I（通过L-鸟氨酸）、蔗糖生物合成II、L-精氨酸生物合成II（乙酰循环）、淀粉生物合成、双歧杆菌分流（Bifidobacterium shunt）以及乳糖和半乳糖降解I。此外，基因本体论（Gene Ontology, GO）富集分析显示，在分子功能（Molecular Function, MF）层面，半乳糖-6-磷酸异构酶活性、谷氨酰胺-tRNA合酶活性等与EPL呈负相关；在细胞组分（Cellular Component, CC）层面，ficolin-1-rich颗粒腔、分泌颗粒腔等与EPL呈负相关；在生物学过程（Biological Process, BP）层面，通过塔格糖-6-磷酸的乳糖分解过程、甘油醛-3-磷酸生物合成过程等与EPL呈负相关。
讨论与结论
讨论部分指出，这是首次在中国西北地区利用宏基因组测序技术探讨肠道菌群与EPL关联的研究。PCoA分析和α多样性结果表明EPL组存在显著的菌群失调和多样性降低，这与既往部分研究一致。在门水平，EPL组中厚壁菌门和放线菌门减少、拟杆菌门增加的现象与部分研究相符，但也与其他研究结果相悖，研究人员推测这可能与地理区域和饮食习惯的差异有关。在属水平，多个与短链脂肪酸（Short-Chain Fatty Acids, SCFAs）产生和肠道稳态相关的菌属（如粪球菌属、Fusicatenibacter、瘤胃球菌属、布劳特氏菌属、多尔氏菌属及毛螺菌科成员）在EPL组中减少，提示EPL组可能存在SCFA产生潜力降低、免疫调节受损和促炎状态。双歧杆菌属作为常见的益生菌属，其在NCs中的富集与其保护性作用相符。罗斯氏菌属在健康个体中的优势地位也与既往研究一致。拟杆菌门在EPL组中的富集可能部分反映了饮食差异，但由于未评估膳食摄入，此解释仍属推测。在种水平，Fusicatenibacter saccharivorans与胆汁酸代谢相关，Ruminococcus bromii和Eubacterium rectale作为重要的产丁酸菌，其减少可能导致抗炎和维持肠道屏障功能的丧失。功能通路分析提示EPL组中碳水化合物和氨基酸代谢潜力发生了改变。研究也指出了局限性：遗传和环境因素未被全面评估；年龄、教育水平和WHR等混杂因素虽经校正但仍无法完全消除残余混杂；横断面设计无法推断因果关系；EPL组粪便样本在流产后采集，无法排除炎症反应、心理应激等因素的后效应。
研究结论： 总之，本研究确定了肠道菌群失调与EPL之间的关联，并为未来的前瞻性和机制性研究提供了基础。
