《Frontiers in Immunology》：Exploiting RAG1-deficient chickens to construct a single-cell transcriptional atlas of chicken heterophils during inflammation
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引言： 禽类异嗜性粒细胞天然缺乏髓过氧化物酶（MPO），使鸡成为研究不依赖MPO的固有免疫策略的独特进化模型。然而，调控异嗜性粒细胞成熟与活化的分子程序在很大程度上仍未阐明。
方法： 研究人员利用RAG1缺陷鸡模型，通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）绘
引言： 禽类异嗜性粒细胞天然缺乏髓过氧化物酶（MPO），使鸡成为研究不依赖MPO的固有免疫策略的独特进化模型。然而，调控异嗜性粒细胞成熟与活化的分子程序在很大程度上仍未阐明。
方法： 研究人员利用RAG1缺陷鸡模型，通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）绘制了紧急粒细胞生成过程中异嗜性粒细胞的成熟图谱，并鉴定出八个转录特征各异的细胞亚群（H0–H7）。研究人员推断出一条跨越转录特征各异的异嗜性粒细胞亚群的发育轨迹，从富集翻译活性、氧化磷酸化（OXPHOS）及存活相关程序基因的早期亚群，延伸至富集效应因子相关基因特征的终末亚群。
结果与讨论： 与哺乳动物中性粒细胞不同，异嗜性粒细胞并未按序启动经典颗粒蛋白基因的表达；相反，其成熟过程以MMP9的渐进性上调为标志。转录谱分析揭示了一氧化氮（NO）信号通路的显著富集，而NADPH氧化酶的表达维持在基础水平。轨迹分析表明，细胞从干扰素刺激基因（ISG）主导的状态转变为具备脱颗粒、吞噬及胞外诱捕网形成能力的效应表型。终末亚群表现出与增强的细胞外基质重塑、急性期反应及营养免疫相关的转录特征。综上，这些发现提供了禽类异嗜性粒细胞的精细单细胞图谱，为理解天然不依赖MPO物种中固有免疫细胞的发育轨迹和转录异质性提供了宝贵的进化见解。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
禽类异嗜性粒细胞是禽类固有免疫系统中的主要粒细胞效应细胞，功能上类似于哺乳动物中性粒细胞，能够快速趋化、高效吞噬并产生促炎细胞因子。然而，禽类异嗜性粒细胞天然缺乏髓过氧化物酶（MPO），这使其成为研究不依赖MPO的抗菌机制的独特进化模型。在急性感染或严重炎症状态下，鸡体会启动类似于哺乳动物紧急粒细胞生成的应答过程，迅速增加异嗜性粒细胞的输出，将成熟和未成熟细胞释放至血液及炎症组织。尽管哺乳动物中以C/EBPβ为核心的紧急粒细胞生成程序已被充分表征，但鸡体内驱动这一紧急应答的特异性转录程序仍不明确。此外，以往研究中异嗜性粒细胞在单细胞水平上极难捕获，严重限制了对异嗜性粒细胞异质性功能状态的深入转录组分析。因此，利用RAG1缺陷鸡模型——该模型因缺乏适应性淋巴细胞而呈现系统性炎症状态，驱动代偿性的紧急粒细胞生成样应答——为在单细胞水平全面解析禽类异嗜性粒细胞的成熟路径和炎症转录程序提供了前所未有的机会。
二、研究内容与主要结论
研究人员通过对比野生型与RAG1缺陷鸡脾脏中的异嗜性粒细胞，系统描绘了禽类异嗜性粒细胞在炎症状态下的成熟轨迹和炎症转录程序。主要结论包括：RAG1缺陷鸡脾脏中异嗜性粒细胞显著扩增，呈现紧急髓系生成样应答特征；鉴定出八个转录特征各异的异嗜性粒细胞亚群（H0–H7），其中H5为野生型脾脏优势亚群，代表稳态未成熟状态，而H4为RAG1缺陷脾脏中的活化态；推断出H5–H4–H0–H1–H6的主要成熟轨迹；与哺乳动物中性粒细胞不同，鸡异嗜性粒细胞未按经典“时序靶向”模式依次表达颗粒蛋白基因，而是以MMP9的渐进性上调作为可靠的终末发育标志；活化异嗜性粒细胞显著上调NOS2而NADPH氧化酶组分维持基础水平，提示其转录层面依赖一氧化氮（NO）通路而非经典氧化爆发程序；终末亚群H6呈现高表达TLR、MAPK/NF-κB信号组分、MMP9、急性期蛋白及营养免疫介质的过度炎症表型。该研究首次提供了禽类异嗜性粒细胞的全面单细胞转录图谱，为禽类—哺乳动物比较免疫学奠定了重要基础。
三、关键技术与方法
研究人员使用了以下主要技术方法：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建RAG1基因敲除鸡模型（种系传递经由原始生殖细胞介导）；采用流式细胞术鉴定脾脏异嗜性粒细胞（CD45?Bu-1?KUL01?SSC^High）；使用10x Genomics Chromium平台进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），对野生型（n=2）和RAG1缺陷鸡（n=2）脾脏样本各捕获7,367和8,853个细胞；基于Seurat包进行聚类分析，以轮廓分数优化聚类参数；使用Slingshot进行轨迹推断，以TSCAN鉴定与拟时序相关的基因；利用DAVID进行GO和KEGG通路富集分析；通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证关键基因表达。
四、研究结果
3.1 鸡脾脏白细胞高分辨率图谱： 通过scRNA-seq对野生型和RAG1缺陷鸡脾脏白细胞进行无偏聚类，鉴定出浆细胞、生发中心B细胞、非典型B细胞、T/NK细胞、树突状细胞、巨噬细胞及异嗜性粒细胞等群体。RAG1缺陷鸡脾脏中异嗜性粒细胞和异嗜性粒细胞-巨噬细胞群体显著扩增，而野生型脾脏以巨噬细胞为主。
3.2 RAG1缺陷脾脏异嗜性粒细胞呈现紧急髓系生成转录特征： 对异嗜性粒细胞亚群进行再聚类后鉴定出八个亚群（H0–H7），其中H0–H4、H6和H7在RAG1缺陷脾脏中占85%–100%，而H5几乎仅在野生型脾脏中（97%）出现。RAG1缺陷优势亚群显著上调紧急粒细胞生成核心转录因子CEBPB、JAK/STAT通路组分（JAK2、STAT1/2/3/5A）及早期应答基因（EGR1、JUN、JUND、FOSL2等），表明缺乏RAG1的高炎症环境激活了鸡异嗜性粒细胞的紧急髓系生成样程序。
3.3 单细胞转录组学定义鸡未成熟异嗜性粒细胞阶段： 基于高翻译活性和高氧化磷酸化（OXPHOS）特征，将H2、H4和H5鉴定为候选未成熟异嗜性粒细胞。其中H4和H5还上调胆固醇生物合成基因（HMGCS1、HMGCR、PMVK），支持颗粒形成。H4作为H5的活化态，显著上调JAK/STAT组分（STAT1）、干扰素刺激基因（IFITM5）及炎症细胞因子（IL18）。
3.4 RAG1缺陷脾脏揭示异嗜性粒细胞成熟程序： 以H5为起点推断出三条潜在轨迹，聚焦H5–H4–H0–H1–H6为主要成熟路径。沿轨迹观察到CEBPA早期高表达后下降、CEBPB总体上升、SPI1持续高表达；增殖标志MYC持续下降而抗增殖基因EGR3先升后降；抗凋亡基因BCL2A1和组织驻留调控因子NR4A2在中间亚群瞬时诱导；趋化因子CX3CL1沿轨迹上升；OXPHOS相关基因NDUFS5渐进下调而糖酵解基因LDHA上调，表明从OXPHOS向糖酵解的代谢转变。
3.5 经典中性粒细胞颗粒分类不适用于鸡异嗜性粒细胞推断轨迹： 大多数哺乳动物经典颗粒基因（MPO、ELANE、CTSG、PRTN3、AZU1、LNX2、MMP8、CAMP、FCGR3、MMP25、VAMP2、STXBP4等）在鸡异嗜性粒细胞各亚群间无差异表达。初级颗粒标志CD63渐进下调而SRGN在终末亚群H6中重新激活；三级颗粒基因ANXA1渐进下调而MMP9持续上升，与哺乳动物模式相反。qRT-PCR证实RAG1缺陷鸡脾脏中MMP9表达显著升高。
3.6 活化鸡异嗜性粒细胞核心炎症基因特征凸显其进化上依赖非氧化性转录程序： 活化异嗜性粒细胞显著上调病毒RNA传感器（IFIH1、DHX58、ZC3HAV1）、干扰素受体（IFNAR1、IFNAR2、IFNGR2）、JAK-STAT组分（JAK2、STAT1、STAT2）、IRFs（IRF1、IRF7）及ISGs（MX1、OASL、RSAD2）；同时上调炎症细胞因子（IL6、IL18、IL1RL1）、脂质介质通路（ALOX5、PTGS2、HPGD）及趋化因子/受体（CX3CL1、CCR2、CCL19）。抗菌效应分子（RNASE6、组织蛋白酶、MMPs、补体组分）、吞噬机制相关基因（FCER1G、RAB5C、RAB7、LAMP1等）及胞外诱捕网形成相关Ca2?信号组分（ITPR2、CAMK2D、CAMK2G）均显著上调。值得注意的是，NADPH氧化酶组分除NCF2外基本不变，而NOS2显著上调，qRT-PCR证实CYBB无显著变化而NOS2显著诱导。GO分析显示富集于对氮化合物的细胞应答（GO:1901699）而非经典氧化爆发通路。
3.7 沿推断异嗜性粒细胞轨迹的炎症程序动态重塑： H0亚群呈现ISG高表达、组织驻留特征，上调淋巴趋化因子（CCL19、CCL21、CXCL13）、嘌呤能受体（P2RY6）、Ca2?信号组分及HDAC2，提示可能具备胞外诱捕网形成的转录准备状态。H1亚群富集脱颗粒和吞噬相关基因（Rab GTPases、膜联蛋白、SNARE组分、组织蛋白酶），并强烈诱导NOS2而NADPH氧化酶组分基本不变。H6亚群呈现终末分化促炎表型，上调多个TLRs（TLR4、TLR1B、TLR15）、MYD88、MAPK和NF-κB通路组分、促炎细胞因子/趋化因子（IL8L1、IL8L2、CXCR1），同时表达最高水平的MMP9、急性期基因（SAA、S100A12、TF），后者提示锌和铁螯合相关的营养免疫功能。
五、讨论与结论
研究人员指出，RAG1缺陷鸡模型为异嗜性粒细胞单细胞分析提供了理想平台，但所观察到的异嗜性粒细胞异质性和成熟轨迹需在慢性炎症背景下解读，许多转录特征可能代表免疫缺陷宿主的代偿性适应。研究鉴定出的异嗜性粒细胞亚群中，部分呈现向组织修复和代偿表型的转分化样转录特征，如H2表达M2巨噬细胞标志、H3呈现促血管生成特征、H7上调T细胞相关基因，这些可能反映髓系细胞在缺乏成熟B/T淋巴细胞时的转录可塑性和代偿应答。核心转录因子CEBPA、CEBPB、SPI1的表达轨迹与哺乳动物中性粒细胞保守，但经典颗粒基因未呈现序贯诱导模式，MMP9的渐进性上调成为可靠的成熟标志。H0亚群可能代表具有延长存活能力的组织驻留异嗜性粒细胞；H1亚群以NOS2诱导为特征，可能反映异嗜性粒细胞在慢性炎症环境中获得巨噬细胞样表型，或与MPO缺陷小鼠中iNOS代偿性增强的机制类似；H6亚群呈现终末分化过度炎症状态，通过MMP9介导的细胞外基质重塑、急性期反应及以S100A12和转铁蛋白（TF）介导的营养免疫发挥抗菌作用，与哺乳动物中性粒细胞依赖S100A8/S100A9和乳铁蛋白（LTF）的策略形成鲜明对比。该研究首次提供了包含八个异嗜性粒细胞亚群的全面转录图谱，重建了H5–H4–H0–H1–H6的经典成熟轨迹，为禽类—哺乳动物比较免疫学奠定了关键基础，揭示了粒细胞生物学中的进化适应以及脊椎动物固有免疫特征的保守性与谱系特异性。
研究结论：通过利用RAG1缺陷鸡模型，研究人员首次在单细胞水平全面绘制了禽类异嗜性粒细胞在炎症状态下的转录图谱，鉴定出八个转录特征各异的亚群，重建了从H5经H4、H0、H1至H6的成熟轨迹。该成熟过程以MMP9渐进性上调为标志，而非哺乳动物经典的序贯颗粒基因表达模式。活化异嗜性粒细胞在转录层面依赖一氧化氮（NO）通路而非NADPH氧化酶介导的氧化爆发，终末亚群则呈现细胞外基质重塑、急性期反应和营养免疫特征。这些发现为理解天然不依赖MPO物种中固有免疫细胞的发育轨迹和转录异质性提供了宝贵的进化见解。
