绝经后女性宫颈病变进展中的阴道菌群特征与功能预测研究

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Vaginal microbiota and functional prediction along the progression of cervical lesions in postmenopausal women

　　

目的： 探讨中国新疆地区绝经后女性中，伴有高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染、宫颈鳞状上皮内病变及宫颈癌（CC）的阴道菌群变化。 方法： 本研究纳入健康绝经后女性（HC组，n=25）、高危型HPV感染绝经后女性（HPV组，n=25）、低度鳞状上皮内病变（LSIL组，n=25）、高度鳞状上皮内病变（HSIL组，n=25）及宫颈癌（CC组，n=25）。研究人员从阴道分泌物中提取DNA，并在Nanopore平台进行全长16S rRNA基因测序。采用EasyAmplicon 2流程进行序列处理与分类学注释，使用PICRUSt2进行功能预测，并使用R软件进行阴道菌群多样性及统计分析。 结果： 在五组绝经后女性中，Shannon和Simpsonα多样性指数相当，而Chao1/ACE丰富度存在显著差异（p < 0.05）。PERMANOVA分析显示ASV水平β多样性无分离，但在门水平存在显著差异（R2 = 0.105，p = 0.001）。惰性乳杆菌（Lactobacillus iners）在所有样本中占优势，但在CC组中丰度下降，同时机会性病原菌升高。LEfSe筛选出组特异性菌群：约氏乳杆菌（L. johnsonii）（HC组）、Dialister pneumosintes（LSIL组）、Candidatus Saccharibacteria（HSIL组）及链球菌属（Streptococcus）spp./脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）（CC组）。HC vs CC比较中差异丰度菌种（DABs）最多（35种），LSIL vs HSIL最少（13种）。共现网络复杂度在LSIL/HSIL阶段达到峰值（41个相关配对），在CC组下降（28个配对）。共鉴定出92条差异KEGG通路，其中60条在LSIL组富集。L. iners与多种代谢通路呈现双向相关性，表明在宫颈病变进展过程中，阴道菌群的结构、相互作用及功能发生了全面重塑。 结论： 在绝经后女性中，从高危型HPV感染进展至宫颈癌的过程中，阴道菌群发生进行性失调。每个疾病阶段均观察到独特的菌群改变，其中LSIL阶段发生显著的功能重塑。这些发现为早期干预及微生物标志物研究提供了参考。

绝经后女性宫颈病变进展中的阴道菌群动态变化：基于Nanopore全长16S rRNA测序的物种水平与功能预测研究解读

一、研究背景与意义

绝经后女性因雌激素水平下降，阴道微环境发生显著重塑，表现为阴道上皮糖原生成减少和阴道干涩，进而引起阴道菌群组成深刻变化。既往研究已证实，与绝经前女性相比，健康绝经后个体乳杆菌属（Lactobacillus）丰度和多样性均较低。这些微生态紊乱可能加剧高危型HPV持续感染，并加速癌前宫颈病变向浸润性宫颈癌的进展。因此，依据HPV状态和宫颈病变严重程度分层，绘制绝经后患者阴道微生物特征图谱，可为指导个体化临床干预提供有力证据。

目前多数阴道微生物组研究依赖针对16S rRNA基因部分可变区的短读长测序，该方法无法提供精确的物种水平分类分辨率。关键问题在于，同属不同细菌物种常发挥截然不同的生理效应：某些菌株维持黏膜稳态，而另一些则与宫颈病理表型相关，近缘类群间致病能力存在显著差异。因此，高分辨率的物种水平微生物分析在生殖道微生态研究中极为必要。牛津纳米孔技术（ONT）长读长测序可生成约1.5 kb的全长16S rRNA基因扩增子，凭借其优越的分类分辨能力，支持精确的物种水平注释、稳健的系统发育树构建以及多微生物群落的综合功能推断。本研究即采用该技术，对新疆绝经后女性五个亚组（健康对照、单纯高危型HPV感染、LSIL、HSIL及浸润性宫颈癌）的阴道微生物组特征进行系统表征，旨在描绘宫颈病变全谱进展过程中阴道群落组成、物种间共现网络及微生物功能能力的阶梯式变化。

二、研究设计与技术方法

研究人员自2025年9月至2025年12月期间，从新疆医科大学第一附属医院妇科招募绝经后女性受试者。纳入标准包括：已绝经（闭经不少于1年，且FSH和LH均超过40 IU/L）、有一年以上性生活史、高危型HPV阳性患者在本院接受阴道镜宫颈活检或宫颈锥切术并获得术后病理诊断（CC、HSIL、LSIL及慢性宫颈炎）、在新疆居住一年以上。排除标准涵盖采集前一周内有性活动、两周内有阴道冲洗或用药史、一个月内使用抗生素或性激素、有子宫切除术史、生殖道肿瘤放疗或化疗史、其他恶性肿瘤或全身免疫性疾病。研究经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准（批号：K202504-45），所有参与者签署书面知情同意书。全部受试者按高危型HPV状态和病理结果分为五组：HC组（高危型HPV和TCT均阴性且无宫颈病理病变的健康体检者）、HPV组（高危型HPV阳性且病理诊断为慢性宫颈炎）、LSIL组（高危型HPV阳性且病理诊断为LSIL，对应CIN1）、HSIL组（高危型HPV阳性且病理诊断为HSIL，包括CIN2和CIN3）及CC组（高危型HPV阳性且病理确诊为CC），每组25例，共125例。

关键技术方法包括：阴道分泌物标本采集后提取总基因组DNA，采用ONT PromethION平台进行全长16S rRNA基因测序；通过EasyAmplicon 2流程进行序列处理、ASV聚类和分类学注释；使用PICRUSt2进行基于ASV序列的微生物功能预测；所有后续分析（包括α和β多样性评估、统计假设检验、LEfSe差异菌群筛选、微生物共现网络构建及PICRUSt2功能输出的统计评估）均在R软件（v4.3.1）中完成。

三、研究结果

3.1 人口学特征

共纳入125名绝经后女性，每组25例。各组在年龄、体质指数（BMI）、绝经年龄、民族、居住地和婚姻状况方面无显著差异（均p > 0.05）。绝经年限存在显著组间差异（H = 10.85，p = 0.0283），事后Bonferroni检验显示HPV组绝经时长显著长于HSIL组（校正后p = 0.0198）。孕次也存在显著组间差异（H = 12.51，p = 0.0139），校正后HC组孕次显著低于HSIL组（校正后p = 0.0334）和CC组（校正后p = 0.0372）。

3.2 测序结果

从125份样本中共获得11,129,640条高质量清洁读段，每样本平均89,037 ± 42,084条。共检出2,405个扩增子序列变异（ASV），其中1,096个为五组共有。各组ASV总数分别为：HC组1,651、HPV组1,812、LSIL组1,791、HSIL组1,844、CC组1,891。平均观测ASV数HC组最低（283.04），CC组最高（277.64的表述有误，实际为CC组1,891总数最高）。分类学注释鉴定出13个门、18个纲、35个目、63个科、106个属和289个种。所有组的稀释曲线均达到平台期并相互重叠，表明测序深度足以覆盖样本中绝大多数微生物物种。

3.3 不同宫颈病变阶段阴道微生物群落特征

ASV水平α多样性分析显示，Chao1、ACE指数和Good's覆盖度存在显著组间差异（p = 0.0223、p = 0.0333和p < 0.001），而Richness、Shannon、Simpson、InvSimpson和Pielou指数无显著差异（均p > 0.05）。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）结合置换多元方差分析（PERMANOVA）显示，ASV水平五组间微生物组成无显著差异（R2 = 0.038，p = 0.142），PCoA图显示各组样本大量重叠。鉴于ASV数据的高维稀疏性可能掩盖群落结构的整体变化，研究人员进一步在六个分类水平（门、纲、目、科、属、种）进行PERMANOVA分析，发现门水平存在高度显著的组间微生物组成差异（R2 = 0.105，p = 0.001），对应PCoA图显示CC与HC组间部分分离。纲、目、科和种水平也存在显著差异（均p < 0.05），属水平无显著差异（p > 0.05）。R2值随分类分辨率提高而逐渐降低，表明与宫颈病变相关的菌群变化主要由优势门（包括芽孢杆菌门（Bacillota）和拟杆菌门（Bacteroidota））相对丰度波动驱动。物种水平热图显示，惰性乳杆菌（Lactobacillus iners）为总体最丰富物种。

狄利克雷多项式混合（DMM）无监督聚类将所有样本划分为三种群落类型（Cluster 1–3）。Cluster 1以阴道范妮氏菌（Fannyhessea vaginae）、咽峡炎链球菌（Streptococcus anginosus）、双歧普雷沃菌（Prevotella bivia）、卷曲乳杆菌（L. crispatus）和L. iners为特征，呈现乳杆菌与兼性厌氧菌共存模式。Cluster 2以L. iners为主导，平均相对丰度达90.9%。Cluster 3由副加氏乳杆菌（L. paragasseri）和加氏乳杆菌（L. gasseri）主导，合计相对丰度超过55%。CC组80%样本归属于Cluster 1，卡方检验显示组间无显著差异（p = 0.178），但CC组中Cluster 1富集趋势提示该群落类型可能与宫颈癌进展相关。桑基图显示芽孢杆菌门（Bacillota）在各组均占优势，但优势种因队列而异：HC组以Streptococcus sp. Marseille-P8640为主，HPV组以L. crispatus为主，LSIL组以L. paragasseri为主，HSIL组以L. iners为主，CC组以约氏乳杆菌（L. johnsonii）为主。拟杆菌门（Bacteroidota）中，P. bivia在HC组占优，阴道普雷沃菌（P. vaginalis）在HPV组占优，牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）在LSIL、HSIL和CC组占优。

LEfSe分析（LDA > 2且p < 0.05）鉴定出28个差异分类单元，其中24个获得明确分类学注释。L. johnsonii（LDA = 4.27）和放线菌门（Actinomycetota）下分类群在HC组富集；Dialister pneumosintes、弯曲杆菌属（Campylobacter）sp.等分类群在LSIL组富集；Candidatus Saccharibacteria门及其对应物种在HSIL组富集；多种链球菌属（Streptococcus）spp.、Bacteroidaceae a和脆弱拟杆菌（B. fragilis）在CC组富集。HPV组未检出差异生物标志物。事后Dunn检验（Bonferroni校正）确认L. johnsonii在HC组、Ca. Saccharibacteria在HSIL组、Campylobacter sp.和L. paragasseri在LSIL组、Streptococcus spp.和B. fragilis在CC组丰度显著升高（均校正后p < 0.05）。

3.4 不同宫颈病变阶段阴道菌群的群落结构、差异物种及共现网络

研究人员对四个核心配对比较（HC vs CC、HC vs HSIL、HPV vs CC、LSIL vs HSIL）进行物种水平Mann-Whitney U检验（FDR校正q < 0.05），分别鉴定出35、24、24和13种差异丰度菌种（DABs），主要属于芽孢杆菌门（Bacillota）、放线菌门（Actinomycetota）和拟杆菌门（Bacteroidota）。HC vs CC比较产生最多DABs（35种），其中23种归入Bacillota。CC组中L. johnsonii和德氏乳杆菌（L. delbrueckii）等乳杆菌被耗竭，而D. pneumosintes、B. fragilis和消化球菌属（Peptoniphilus）sp.等机会性病原菌富集。HC vs HSIL比较检出24种DABs，其中5种属于假单胞菌门（Pseudomonadota），提示HSIL可能伴随兼性厌氧菌入侵。HPV vs CC比较同样产生24种DABs，反映从HPV感染进展至CC过程中菌群明显重塑，表现为乳杆菌减少和病原菌升高。LSIL vs HSIL比较仅发现13种DABs，其中9种为Bacillota，表明从低度到高度病变进展过程中微生物群落变化较温和。

对五组共有丰度前30物种进行Spearman相关分析（|r| > 0.2且FDR校正q < 0.05），各组显著相关配对数为：HC = 30、HPV = 32、LSIL = 41、HSIL = 41、CC = 28。共现网络复杂度在LSIL和HSIL阶段上升，在CC组下降。机会性病原菌间检测到稳定的正相关，如解脲弯曲杆菌（Campylobacter ureolyticus）与地中海厌氧球菌（Anaerococcus mediterraneensis）在五组中均呈强正相关（r = 0.64–0.96）。大芬戈尔德菌（Finegoldia magna）与生殖道消化链球菌（Peptoniphilus genitalis）在HC、LSIL和HSIL组持续共现（r > 0.78）。乳杆菌间种间关联随病变进展动态变化：HC组L. crispatus与L. gasseri强正相关，L. iners与D. micraerophilus负相关；HPV组L. johnsonii与Streptococcus sp.正关联增强；LSIL组L. crispatus与微小脲原体（Ureaplasma parvum）间观察到高相关系数；HSIL组L. paragasseri与L. gasseri保持强正相关，L. iners与气球菌属（Aerococcus christensenii）负相关；CC组L. johnsonii与A. christensenii间存在极强正相关，L. delbrueckii与肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）正相关。病变特异性强病原菌互作仅在HSIL和CC样本中观察到：HSIL中大肠杆菌（Escherichia coli）与K. pneumoniae强相关；CC中独特强相关包括K. pneumoniae与L. delbrueckii，以及阴道斯尼斯菌（Sneathia vaginalis）与U. parvum。

3.5 功能预测及物种-通路关联分析

3.5.1 功能预测

PICRUSt2功能预测显示，代谢（Metabolism）是五组中占主导的KEGG一级功能类别，占总功能的70%以上。尽管一级类别总体组成在各组间相当，但Kruskal-Wallis检验显示所有类别均存在显著组间差异（FDR校正p < 0.001）。在KEGG三级通路水平，92条通路在各组间丰度存在显著差异（FDR校正p < 0.05）。HPV组富集22条通路，包括ABC转运蛋白和细菌分泌系统。LSIL组富集通路最多（60条），涵盖丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、糖酵解/糖异生及核糖体相关功能。HSIL组富集7条通路，主要为丁酸代谢和色氨酸代谢。HC和CC组均无通路达到最高平均丰度。92条差异通路热图显示，大多数通路在LSIL组丰度较高，HC组整体丰度较低，HPV组分泌相关通路显著富集。

3.5.2 物种-通路相关性

Spearman相关分析（|ρ| > 0.5且FDR校正p.adj < 0.05）共鉴定出17对显著物种-通路相关配对。HC组富集的耐硼红球菌（Rhodococcus boritolerans）与柠檬烯和蒎烯降解呈强正相关（|ρ| = 0.742）。L. iners与多种通路呈双向相关：正相关包括苯乙烯降解、亚油酸代谢等（|ρ|范围0.50–0.61），负相关包括万古霉素类抗生素生物合成和柠檬酸循环（TCA循环）等（|ρ|范围?0.64至?0.50）。Brevundimonas sp. XJ-412与D-丙氨酸代谢、玉米素生物合成等通路显著负相关（|ρ|范围?0.52至?0.51）。D. micraerophilus与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成呈正相关（|ρ| = 0.50）。

四、讨论与结论

讨论总结： 本研究是新疆地区首次利用Nanopore全长16S rRNA测序表征绝经后女性高危型HPV感染相关阴道菌群的研究。物种水平分析表明L. iners是大多数样本的优势物种，随着宫颈病变进展，群落组成发生显著变化：CC组中L. iners优势度显著下降，而P. bivia和S. vaginalis等机会性病原菌丰度增加；HSIL和LSIL组仍以L. iners为主，但富集了兼性厌氧菌S. anginosus和专性厌氧菌F. magna；HC组菌群结构相对稳定。α多样性分析显示Shannon和Simpson指数无显著组间差异，而Chao1和ACE指数存在显著差异，物种总数从HPV感染至LSIL和HSIL阶段逐渐增加，宫颈癌阶段虽有所下降但仍高于HPV组。P. bivia与细菌性阴道病和持续HPV感染相关，Sneathia属在阴道生物膜形成中发挥重要作用，链球菌在HPV感染及各级病变患者阴道菌群中检出率显著升高。L. iners在阴道菌群中的作用具有多面性：其基因组缺乏D-乳酸脱氢酶基因，仅合成L-乳酸而不产生D-乳酸，而D-乳酸对病原菌的抗菌活性强于L-乳酸，因此L. iners主导的群落维持酸性阴道环境的能力较弱；其基因组还编码与阴道加德纳菌（Gardnerella vaginalis）溶血素同源的孔形成毒素inerolysin，可能在特定微环境条件下损伤宿主上皮细胞。L. iners与HPV感染的关系在不同研究中结果不一致，可能源于参与者激素状态、入组标准和样本采集程序的差异。本研究发现L. iners在HC、HPV、LSIL和HSIL组保持高丰度，但在CC组急剧下降，提示宫颈癌局部微环境可能不利于L. iners定植；仅在病变组（LSIL/HSIL/CC）检测到L. iners与厌氧菌的负相关，提示病变进展过程中两者间可能存在拮抗作用。瘤内L. iners产生的L-乳酸可驱动肿瘤代谢重编程并诱导宫颈癌细胞放化疗抵抗，同时抑制T细胞功能、促进调节性T细胞分化并削弱宿主抗肿瘤免疫应答。Spearman相关分析显示L. iners丰度与多条KEGG功能通路显著相关，可能通过抑制能量代谢相关通路和上调炎症信号级联来调节绝经后宫颈病变女性的宫颈阴道微环境。LSIL阶段可能是阴道菌群功能重塑的关键转折点。

研究结论翻译： 本研究基于Nanopore平台的全长16S rRNA测序，表征了从HPV感染进展至宫颈癌过程中阴道菌群的动态变化。ASV水平上未观察到整体微生物结构的显著差异，而门水平和功能通路发生了显著重塑。随着宫颈病变加重，D. pneumosintes和B. fragilis等机会性病原菌富集，而L. johnsonii和L. delbrueckii等部分乳杆菌被耗竭。微生物共现网络复杂度在LSIL和HSIL阶段达到峰值，在宫颈癌中下降。功能上，LSIL组富集的代谢通路数量最多。L. iners与多种通路表现出双向相关性，提示其可能作为疾病进展中的功能调节因子。这些发现为识别微生物生物标志物和探索宫颈病变的潜在机制提供了有价值的线索。