成人及老年人大脑中甲状腺激素转运体MCT8的多尺度表征与区域分布研究

《Acta Neuropathologica Communications》：Multiscale characterization and distribution of the thyroid hormone transporter MCT8 in the adult and aged human brain

　　

专业摘要翻译 甲状腺激素（thyroid hormones, TH）的局部可用性依赖于TH转运体，如单羧酸转运体8（monocarboxylate transporter 8, MCT8，由SLC16A2编码）。SLC16A2基因突变可导致Allan-Herndon-Dudley综合征（AHDS），该疾病以严重的神经发育和运动缺陷为特征。尽管MCT8在胎儿大脑发育中的重要性已得到充分证实，但其在成人人大脑中的精确地形学、细胞和亚细胞分布仍未得到充分表征，这限制了研究人员对哪些结构在一生中依赖于MCT8介导的TH转运，以及神经退行性过程（如阿尔茨海默病，Alzheimer's disease, AD）是否影响局部转运体可用性的理解。在本研究中，研究人员系统绘制了来自14例老年人体捐献者8个功能不同脑区的MCT8表达图谱。多尺度研究方法结合了免疫染色、对超过1300万个细胞的自动化全切片图像分析、多重RNAscope原位杂交、受激发射损耗（stimulated emission depletion, STED）显微镜以及单细胞核RNA测序数据分析。研究人员还应用了标准化的Braak分期，以探讨AD进展是否与MCT8表达的改变相关。研究证明了MCT8在脑屏障、胶质细胞以及不同神经元群体中的稳健表达。RNAscope证实了SLC16A2 mRNA的存在与MCT8免疫反应性之间存在高度一致性。STED和共聚焦显微镜将MCT8定位于质膜、核周区域以及轴突/树突区室，表明其在TH的跨细胞和细胞内转运中均发挥作用。MCT8表达在Braak各分期中保持稳定，在具有不同程度神经原纤维病理的捐献者之间无显著差异。研究结果建立了人脑中MCT8介导转运的综合细胞和区域框架，绘制了其在运动控制和认知处理关键区域中的特定解剖分布。MCT8表达在Braak各分期中的稳定性表明，AD中的脑TH失调可能反映了激素代谢的改变而非转运体的缺失。

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一、研究背景与科学问题

甲状腺激素（thyroid hormones, TH）对人脑的发育和生理功能维持具有至关重要的影响。TH需跨越血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）及细胞质膜才能进入脑内各类靶细胞，这一过程依赖TH转运体，如单羧酸转运体8（monocarboxylate transporter 8, MCT8，由SLC16A2基因编码）和有机阴离子转运多肽1C1（OATP1C1）等。MCT8因其对TH的高度特异性而尤为重要。在人类发育过程中，MCT8是TH向胎儿递送的主要途径，调控TH跨胎盘转运并确保发育中脑实质获得充足的TH供应。MCT8缺乏症，即Allan-Herndon-Dudley综合征（AHDS），由SLC16A2基因突变引起，患者因局部脑TH剥夺而出现严重的全面发育迟缓和运动障碍，这凸显了TH在早期神经发育中的关键作用。

在整个生命过程中，TH持续影响神经发生、髓鞘形成和脑代谢。TH供应功能障碍可导致神经精神疾病、成人神经发生减少，并可能与痴呆、记忆丧失和注意力受损相关。在成人人大脑中，MCT8表达已在脑屏障（包括血管和脉络丛细胞）及下丘脑的胶质细胞和神经元中被描述。近期研究在成人运动皮层、基底节和丘脑的周细胞、锥体神经元、GABA能中间神经元亚型、星形胶质细胞及（有髓）神经丝中描述了MCT8的表达，而小胶质细胞表达OATP1C1但不表达MCT8。此外，SLC16A2的常见多态性与健康成人注意力、警觉性和计划等认知领域的个体间差异相关。

尽管MCT8在胎儿脑发育中的重要性已被充分证实，但其在成人及老年人大脑中的精确地形学、细胞和亚细胞分布仍未得到全面表征，这限制了对哪些结构在一生中依赖于MCT8介导的TH转运，以及神经退行性过程（如阿尔茨海默病，Alzheimer's disease, AD）是否影响局部转运体可用性的理解。流行病学研究已将异常TH水平与AD联系起来，但各项研究结果方向不一，荟萃分析证据倾向于甲状腺功能减退是与AD更一致的发现。然而，MCT8表达如何影响AD进展或反之亦然的数据仍然稀少。因此，本研究旨在填补这一知识空白，系统绘制MCT8在成人及老年人大脑中的区域、细胞和亚细胞分布，并评估其表达是否随神经原纤维病理改变。

二、研究设计与主要结论

研究人员从莱比锡解剖研究所的遗体捐献项目中获取了14例年龄64至101岁（平均88.0±9.0岁）个体的脑组织样本，涵盖八个功能不同的脑区：运动功能（初级运动皮层/中央前回和小脑）、感觉处理（枕叶皮层）、高阶联合和执行功能（额叶和颞叶皮层）、学习和记忆（海马和内嗅皮层）以及稳态和自主调节（下丘脑和延髓）。研究采用多尺度分析方法，结合免疫染色、自动化全切片图像分析（共分析13,664,502个细胞）、多重RNAscope原位杂交、受激发射损耗（STED）超分辨显微镜以及公开的单细胞核RNA测序（snRNA-seq）数据分析。同时应用标准化Braak分期评估AD进展与MCT8表达变化的相关性。

研究得出以下主要结论：MCT8在所有分析区域均有表达，但神经元和非神经元细胞群呈现不同的区域模式；MCT8在脑屏障、胶质细胞和特定神经元群体中稳健表达；RNAscope证实SLC16A2 mRNA与MCT8蛋白高度一致；STED和共聚焦显微镜将MCT8定位于质膜、核周区域和轴突/树突区室；MCT8表达在Braak各分期中保持稳定，不同神经原纤维病理程度的捐献者之间无显著差异。这些发现建立了人脑中MCT8介导转运的综合细胞和区域框架，并提示AD中的脑TH失调可能反映激素代谢改变而非转运体缺失。

三、关键技术方法

研究人员使用了以下主要技术方法：第一，免疫荧光标记，采用四种靶向不同表位的MCT8抗体（N端多克隆、C端多克隆、中间区域多克隆和N端单克隆），并在MCT8基因敲除小鼠组织中验证特异性，最终选用N端多克隆抗体用于全部分析。第二，自动化全切片图像分析，使用Zeiss AxioScan切片扫描仪以20× magnification采集全切片图像，通过QuPath 0.4.3和StarDist进行细胞核识别和荧光信号阈值分割，共分类13,664,502个细胞。第三，多重RNAscope原位杂交，使用SLC16A2、RBFOX3和P2RY12探针结合免疫荧光，验证mRNA与蛋白的共定位。第四，STED超分辨显微镜，结合Lamin B1抗体定量分析MCT8与核纤层的空间关系。第五，公开snRNA-seq数据分析，利用Allen Brain Cell Atlas的人类全脑转录组细胞类型图谱（超过300万个单细胞核转录组）分析SLC16A2在不同脑区和细胞类型中的表达。样本队列来源为14例德国莱比锡遗体捐献者（年龄64-101岁，死后间隔13-36小时），涵盖八个脑区共78张切片。

四、研究结果

MCT8抗体染色性能比较：四种抗体均在MCT8敲除组织中无特异性信号。C端抗体信号弱；N端多克隆抗体信号最强且最一致，显示膜性和核周信号；中间区域抗体主要标记核周区室；N端单克隆抗体信号稳健。基于此，研究选用N端多克隆抗体作为主要抗体。

MCT8在脑非神经元细胞中的表达：MCT8在脑屏障中丰富表达，包括内皮细胞、血管周细胞（周细胞样位置）、星形胶质细胞、脉络丛上皮细胞和衬覆第三脑室的tanycytes。血管周细胞中部分显示MCT8信号环绕胞体，部分无信号。星形胶质细胞中，灰质内仅少数GFAP阳性星形胶质细胞在血管接触处显示MCT8免疫反应性，而白质中MCT8阳性星形胶质细胞更常见。脉络丛中MCT8信号集中在面向脑室的顶膜面。tanycytes中MCT8存在于胞体、顶面和基底突起近端，随突起延伸而减弱。少突胶质细胞中仅稀疏共定位，大多数CNPase阳性胞体缺乏MCT8免疫反应性。未观察到小胶质细胞形态的MCT8阳性细胞。

MCT8在神经元中的表达：MCT8免疫反应性在所有检查脑区的神经元中一致存在。共聚焦分析揭示了两种主要模式：大神经元显示突出的膜性MCT8信号环绕胞体并延伸至顶树突和基底树突，主要见于海马、颞叶皮层和运动皮层；较小神经元显示较不广泛的信号。MCT8与NF-H阳性轴突和MAP2阳性树突共定位，信号呈点状分布。GAD67阳性GABA能神经元亚群和酪氨酸羟化酶（THy）免疫反应性神经元中检测到MCT8表达。VGLUT1阳性突触前末梢与MCT8阳性神经元胞体膜紧密并列，表明这些神经元接收谷氨酸能突触输入。

SLC16A2 mRNA表达模式及与MCT8蛋白的相关性：RNAscope在甲状腺滤泡细胞中验证了探针特异性。在脑组织中，P2Y12免疫反应性小胶质细胞胞体中未检测到SLC16A2探针信号，证实小胶质细胞不表达MCT8。SLC16A2与RBFOX3信号在神经元中共定位，但部分RBFOX3阳性神经元无SLC16A2信号。MCT8免疫信号与SLC16A2探针信号在同一细胞中检测到，mRNA和蛋白信号总体高度一致，但并非所有SLC16A2阳性细胞均显示可检测的MCT8抗体信号。

STED显微镜揭示MCT8信号邻近核纤层：STED超分辨显微镜显示MCT8与Lamin B1信号紧密空间关联。通过高斯曲线拟合荧光强度峰，计算MCT8与Lamin B1峰间距离，10个细胞核的平均距离为30.7 nm，表明MCT8不仅存在于细胞膜，还位于核纤层附近或之上。

区域分析揭示人脑中MCT8表达的差异性：在8个脑区共13,664,502个细胞中，MCT8表达细胞在所有区域均被检测到，但区域间两两比较均未达统计学显著。描述性分析显示小脑值最低，延髓和运动皮层最高。将神经元和非神经元区室分开分析后，揭示了不同的区域模式：非神经元细胞中，下丘脑和海马区表达最低，额叶和枕叶皮层最高，海马区与额叶皮层（p=0.023）和枕叶皮层（p=0.025）均有显著差异。神经元区室中，运动皮层和延髓表达最高。密度图显示颞叶皮层第V层存在MCT8阳性神经元热点，而MCT8阳性非神经元细胞热点位于皮质下白质。延髓中MCT8免疫反应性主要存在于大直径轴突轮廓和血管中，舌下核和下橄榄核的个别神经元也呈MCT8阳性。小脑中MCT8主要限于血管和星形胶质细胞样细胞，NeuN阳性/MCT8阳性神经元罕见。下丘脑中MCT8阳性NeuN阴性细胞富集于第三脑室壁附近，而MCT8阳性神经元弥漫分布于实质中。

五、讨论与结论

研究讨论部分指出，MCT8在脑屏障、胶质细胞和特定神经元群体中的广泛表达，为理解MCT8介导的TH转运在成人及老年人大脑中的作用提供了全面的解剖学框架。MCT8在质膜、核周区域和轴突/树突区室的定位表明其同时参与TH的跨细胞和细胞内转运。MCT8在运动皮层和延髓中的高神经元表达比例，可能有助于解释MCT8缺乏症患者中观察到的运动障碍。MCT8表达在Braak各分期中保持稳定，不同神经原纤维病理程度之间无显著差异，这一发现提示AD中的脑TH失调可能反映激素代谢的改变而非转运体的缺失。

研究结论：本研究建立了人脑中MCT8介导转运的综合细胞和区域框架，绘制了其在运动控制和认知处理关键区域中的特定解剖分布。MCT8表达在Braak各分期中的稳定性表明，AD中的脑TH失调可能反映激素代谢改变而非转运体缺失。