《BMC Chemistry》：Green ratio-manipulating spectrophotometric methods for simultaneous determination of empagliflozin and sitagliptin in pharmaceutical formulations
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背景：恩格列净（EMP）与西格列汀（SIT）为作用机制互补的抗糖尿病药物，常制成固定剂量复方制剂。然而，二者紫外吸收光谱严重重叠，限制了直接分光光度法在复方剂型中的应用。
目的：本研究旨在开发并验证简便、快速、低溶剂消耗的比率操作分光光度法，用于复方制剂中EM
背景：恩格列净（EMP）与西格列汀（SIT）为作用机制互补的抗糖尿病药物，常制成固定剂量复方制剂。然而，二者紫外吸收光谱严重重叠，限制了直接分光光度法在复方剂型中的应用。
目的：本研究旨在开发并验证简便、快速、低溶剂消耗的比率操作分光光度法，用于复方制剂中EMP与SIT的同时测定，并评估其分析性能、环境友好性及实际适用性。
方法：研究建立了两种数学分光光度方法，即比率差示法（RD）和一阶导数比率分光光度法（1DD）。在RD法中，EMP通过230 nm与285 nm处的振幅差值定量，SIT则通过257 nm与209 nm处的振幅差值测定。在1DD法中，采用Δλ = 8 nm及缩放因子80，于239 nm处测定EMP、250 nm处测定SIT的一阶导数比率光谱值。研究人员依据线性、准确度、精密度、选择性、稳健性及灵敏度对方法进行了验证，并采用碳足迹削减指数（CaFRI）、Complex Modified Green Analytical Procedure Index（ComplexMoGAPI）、Click Analytical Chemistry Index（CACI）、Blue Applicability Grade Index（BAGI）及Whiteness Evaluation for Chemical Analysis（WECA）工具评估其环境与实用性特征。
结果：两种方法在EMP 2–25 μg/mL及SIT 5–100 μg/mL浓度范围内均呈线性。RD法中，EMP与SIT的检出限（LOD）分别为0.326与0.419 μg/mL，定量限（LOQ）分别为0.978与1.257 μg/mL；1DD法中，相应LOD值为0.324与0.423 μg/mL，LOQ值为0.972与1.269 μg/mL。平均回收率介于99.18%–100.11%之间，重复性与中间精密度相对标准偏差（%RSD）分别不超过0.761%与0.979%。研究人员以乙醇为分析溶剂，成功将所提方法应用于市售复方片剂。Student's t检验与F检验显示，在95%置信水平下，所提方法与已报道方法之间无显著差异。
结论：所开发的RD与1DD方法为同时分光光度测定EMP与SIT提供了快速、无需分离且可靠的替代方案。其使用乙醇、样品制备简便、溶剂消耗低，且具有良好的分析、环境及实用性特征，适用于常规药品质量控制分析，尤其适合色谱资源有限的实验室。
论文解读：基于比率图谱操作的分光光度法同时测定恩格列净与西格列汀复方制剂
一、研究背景与问题提出
2型糖尿病是一种需要长期药物干预的慢性代谢性疾病，单一药物疗法血糖控制不足时，联合用药已成为重要治疗策略。恩格列净（EMP）作为钠-葡萄糖协同转运蛋白2（SGLT2）抑制剂，通过抑制肾脏葡萄糖重吸收、增加尿糖排泄降低血糖；西格列汀（SIT）作为二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制剂，通过增强肠促胰岛素活性促进葡萄糖依赖性胰岛素分泌并抑制胰高血糖素释放。二者作用机制互补，已被制成固定剂量复方制剂用于2型糖尿病管理。
复方制剂的大量使用对分析方法提出了准确性、选择性和实用性要求。已有EMP和SIT的单独测定方法包括紫外分光光度法、荧光法、高效液相色谱法（HPLC）及电化学方法等，但二者联合测定的报道相对有限。已报道的联合测定方法包括联立方程紫外分光光度法和反相高效液相色谱法（RP-HPLC）。联立方程法虽简便快速，但严重的光谱重叠和对吸光系数准确性的依赖限制了其性能；RP-HPLC虽具有高选择性，但需要更复杂的仪器和操作条件，依赖常规流动相溶剂。此外，EMP与SIT的零阶吸收光谱在分析区域内严重重叠，直接分光光度法无法可靠测定。
因此，本研究旨在开发一种将直接分光光度法的简便性与数学解析光谱干扰相结合的分析策略，以解决上述问题。比率图谱操作提供了一种无需物理或色谱分离即可克服光谱重叠的数学策略，其中比率差示法（RD）利用选定波长处比率振幅之差消除除数组分的恒定贡献，一阶导数比率分光光度法（1DD）则通过导数变换进一步增强光谱分辨率。研究同时采用乙醇作为分析溶剂，以支持更环保的分析流程，并通过多种可持续性评估工具全面表征方法的分析性能、实际适用性与环境兼容性。
二、研究内容与主要结论
研究人员开发并验证了RD和1DD两种互补的比率图谱操作分光光度法，用于EMP与SIT复方制剂的同时测定。RD法中，EMP以230 nm与285 nm处比率振幅差值定量，SIT以257 nm与209 nm处振幅差值测定；1DD法中，采用Δλ = 8 nm和缩放因子80，于239 nm测定EMP、250 nm测定SIT的一阶导数比率光谱值。两种方法在EMP 2–25 μg/mL和SIT 5–100 μg/mL范围内均呈良好线性。方法验证涵盖线性、准确度、精密度、选择性、稳健性和灵敏度，并成功应用于市售Gliempaflozin? SITA 25/100?片剂的分析。统计比较显示，所提方法与已报道方法在95%置信水平下无显著差异。研究还通过CaFRI、ComplexMoGAPI、CACI、BAGI和WECA五种工具对方法的环境可持续性、资源效率、实际适用性和分析白度进行了多维评估，结果表明所提方法在各维度均优于已报道的联立方程法。
三、关键技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：比率差示分光光度法（RD），通过测定比率光谱在两个选定波长处的振幅差值实现目标组分的定量；一阶导数比率分光光度法（1DD），将比率光谱进行一阶导数变换后于特定波长处测定导数振幅；除数浓度优化策略，分别选用80 μg/mL的SIT溶液作为EMP比率光谱的除数、18 μg/mL的EMP溶液作为SIT比率光谱的除数；以及五种可持续性评估工具，包括碳足迹削减指数（CaFRI）、ComplexMoGAPI、Click Analytical Chemistry Index（CACI）、Blue Applicability Grade Index（BAGI）和Whiteness Evaluation for Chemical Analysis（WECA）。分析仪器为Shimadzu UV-1800紫外-可见分光光度计，配备10 mm石英比色皿，数据处理采用UV-Probe 2.4版软件。市售片剂样品为Gliempaflozin? SITA 25/100?片剂（批号EMV250616C），由印度Steris Healthcare生产。
四、研究结果
光谱特征与方法开发：EMP与SIT的零阶紫外吸收光谱在分析区域内显著重叠，无法直接分光光度测定。研究人员开发了RD和1DD两种比率光谱方法，通过数学处理实现重叠信号的解析，无需物理分离步骤。
RD与1DD方法优化：除数浓度是影响比率光谱形状、振幅、平滑度及信噪比的关键参数。经考察多种浓度后，选定80 μg/mL SIT作为EMP比率光谱的除数、18 μg/mL EMP作为SIT比率光谱的除数，所得比率光谱平滑且分辨率良好。
比率差示法：EMP以230 nm与285 nm处比率振幅差值定量，SIT以257 nm与209 nm处振幅差值测定。所选波长对可在另一组分存在下选择性测定目标组分。RD校准曲线在EMP 2–25 μg/mL和SIT 5–100 μg/mL范围内线性良好，决定系数（r2）分别为0.9999和0.9997。
一阶导数比率法：比率光谱经一阶导数变换（Δλ = 8 nm，缩放因子80）后，于239 nm测定EMP、250 nm测定SIT。该波长处共存药物的贡献可忽略。1DD校准曲线在相应浓度范围内线性良好，两种分析物的r2均为0.9998。
方法验证：RD法中EMP和SIT的检出限（LOD）分别为0.326和0.419 μg/mL，定量限（LOQ）分别为0.978和1.257 μg/mL；1DD法相应LOD值为0.324和0.423 μg/mL，LOQ值为0.972和1.269 μg/mL。RD法平均回收率EMP为100.11%、SIT为99.18%，1DD法分别为99.74%和99.32%。RD法重复性%RSD为EMP 0.761%、SIT 0.504%，中间精密度为0.979%和0.651%；1DD法重复性为0.452%和0.653%，中间精密度为0.814%和0.716%。选择性评估中，空白安慰剂未产生可检测干扰，加标安慰剂回收率EMP为99.05%–99.58%、SIT为98.61%–99.76%，%RSD不超过1.21%。
市售片剂分析：所提方法成功应用于Gliempaflozin? SITA 25/100?片剂中EMP和SIT的同时测定，测定结果与标示含量一致。标准加入法回收率为99.46%–100.19%，%RSD ≤ 1.05%，证实片剂基质未对定量产生不利影响。
统计比较：EMP的RD和1DD法计算t值分别为0.581和0.753，F值分别为2.12和1.33；SIT的t值为0.612和0.796，F值为1.85和4.24。所有计算值均低于临界值（t = 2.306，F = 6.388），表明在95%置信水平下所提方法与已报道方法无显著差异。
与已报道方法比较：所提RD和1DD方法的工作浓度范围（EMP 2–25 μg/mL，SIT 5–100 μg/mL）低于已报道联立方程法（50–250 μg/mL），且无需色谱分离。与RP-HPLC法相比，所提方法无需色谱系统、分析柱和流动相制备，仪器和操作要求更低。
绿色性、白度与实际适用性评估：所提方法CaFRI得分为85（报道法74）、ComplexMoGAPI得分为80（报道法71）、CACI得分为85（报道法76）、BAGI得分为77.5（报道法72.5）、WECA得分为89（报道法72），各维度均优于已报道的联立方程法。
五、讨论与结论
讨论部分指出，所提RD和1DD方法通过比率光谱的数学处理实现了严重重叠光谱的解析，无需色谱分离或复杂样品制备。RD方法基于比率光谱两波长处振幅差值，操作简单直接；1DD方法通过导数变换提供额外的光谱分辨能力，两者互为补充。方法使用乙醇作为主要溶剂，溶剂和试剂消耗有限，样品制备仅为溶解-稀释，无需预浓缩或衍生化，兼容常规紫外-可见仪器。五种评估工具的一致性结果表明，所提方法在环境可持续性、碳与资源效率、实际适用性及分析白度方面均具有优势，适合常规药品质量控制实验室应用，尤其是色谱资源有限的实验室。
研究结论：两种比率操作分光光度法（RD和1DD）已成功开发并验证，可用于复方片剂中EMP和SIT的同时测定。两种方法均有效解决了两种药物间显著的光谱重叠问题，无需色谱分离、复杂提取或大量样品制备，在各自工作范围内表现出满意的线性、准确度、精密度、灵敏度和稳健性。成功应用于市售固定剂量复方制剂，且与已报道参考方法无显著统计差异，验证了所提方法在常规质量控制分析中的有效性。可持续性和实际适用性评估显示所提方法具有良好特征，乙醇作为主要溶剂、有限的溶剂和试剂消耗、简化的样品制备及对常规仪器的依赖，有助于降低资源和操作负担。总体而言，所提RD和1DD方法为复方制剂中EMP和SIT的同时质量控制测定提供了简便、经济、无需分离且资源消耗更低的替代方案，其充分的分析性能、简便的操作和良好的可持续性特征使其特别适合常规药品质量控制实验室应用。
