Daam、FMNL与mDia家族成核因子协同调控黑色素瘤细胞皮层肌动蛋白动态

《Cell Communication and Signaling》：Daam-, FMNL-, and mDia-family formins jointly regulate cortical actin dynamics in melanoma cells

　　

摘要专业翻译 富含肌动蛋白的细胞皮层是一种黏弹性结构，对于细胞迁移和分裂等过程至关重要，然而，在哺乳动物细胞中构建并调控皮层的肌动蛋白组装因子的完整谱系仍未完全阐明。Arp2/3复合物主要生成由短分支丝状肌动蛋白组成的网络，而mDia1和mDia3等成核因子则组装能够承受细胞后部肌球蛋白驱动收缩所产生的高机械负荷的长直丝状肌动蛋白。为获得调控B16-F1黑色素瘤细胞收缩性皮层力学的成核因子完整名录，研究人员系统筛选了与调控收缩性的Rho家族GTPase相互作用的Diaphanous相关成核因子（DRFs）。该筛选鉴定出Daam1/2和FMNL2/3为皮层成核因子，因为这些成核因子的活性变体以及内源蛋白显著定位于极化B16-F1细胞的后部皮层。酵母双杂交（Y2H）和GST pull-down实验揭示了Daam1/2与活性RhoA、RhoB、RhoC、RhoD和Cdc42的显著相互作用，以及与Rac1和Rif的较弱结合。芘标记肌动蛋白聚合实验和单丝全内反射荧光（TIRF）实验进一步证明，这些GTPase能有效解除Daam家族成核因子的自抑制，其中Daam1和Daam2被证实为强效的丝延长因子。与此一致，CRISPR/Cas9生成的Daam1/2双敲除细胞表现出多种缺陷，包括形成多个前缘、随机二维迁移受损、黏着斑（FA）周转减少以及后部回缩效率低下。然而，与早期研究相反，研究人员未发现Daam1/2调控指状突起形成的证据。相比之下，FMNL2似乎在细胞前端和后部均发挥双重角色成核因子的作用，与多种与收缩性和突起相关的GTPase相互作用并被其激活。分析超速离心进一步澄清了先前的不一致之处，表明FMNL2与GTPase（尤其是Rac1）的亲和力取决于其N端片段的长度以及完整FH3结构域的存在。最后，研究人员证明，缺乏Daam1/2和mDia1/3的细胞表现出明显的皮层缺陷，包括刚性降低、过度起泡和胞质分裂延迟，表明这些成核因子协同维持皮层结构和功能。

论文解读

一、研究背景与科学问题

真核细胞被一层位于质膜下方的富含肌动蛋白的薄皮层所包裹，该皮层对调节细胞形态、决定细胞力学特性以及抵御外部应力至关重要。细胞皮层中肌动蛋白丝的组装主要由两类成核因子驱动：Arp2/3复合物和成核因子（formins）。Arp2/3复合物主要生成分支密集的肌动蛋白网络，见于前缘片状伪足；而成核因子则组装长直丝状肌动蛋白，存在于肌动蛋白束、分裂沟和细胞皮层中。Diaphanous相关成核因子（DRFs）因其N端和C端存在调控元件而天然处于自抑制状态，Rho家族GTPase与N端GTPase结合结构域（GBD）的结合可解除其自抑制从而激活成核因子。

此前研究表明，在B16-F1黑色素瘤细胞中，mDia1和mDia3定位于收缩性后部皮层，其缺失导致多前缘形成和迁移缺陷。然而，mDia1/3双敲除在B16-F1细胞中的表型严重程度远低于NIH 3T3成纤维细胞，提示B16-F1细胞中可能存在其他皮层成核因子以维持收缩性后部皮层的力学特性。因此，系统鉴定哺乳动物细胞中皮层成核因子的完整谱系并解析各自贡献，成为该领域的重要研究目标。该论文发表于《Cell Communication and Signaling》。

二、主要技术方法

研究人员综合运用了多种关键技术：酵母双杂交（Y2H）筛选鉴定成核因子与Rho家族GTPase的相互作用；GST pull-down实验验证蛋白间直接结合；芘标记肌动蛋白聚合实验和单丝全内反射荧光（TIRF）显微镜实时观测肌动蛋白丝的成核与延长动力学；分析超速离心（AUC）定量测定蛋白结合亲和力；CRISPR/Cas9基因编辑技术构建多种组合敲除细胞系；免疫印迹和TIDE/DNA测序验证基因敲除效率；RNA-Seq分析基因表达谱；荧光漂白后恢复（FRAP）测定肌动蛋白聚合速率；微吸管抽吸实验（MPA）测量细胞皮层刚性；差示干涉（DIC）和相衬延时显微成像监测细胞迁移、起泡和胞质分裂行为。研究以B16-F1小鼠黑色素瘤细胞为主要模型。

三、研究结果

皮层成核因子谱系的界定

Y2H筛选显示，Daam1与活性RhoA、RhoB、RhoC、RhoD、Rif和Cdc42发生强特异性相互作用，Daam2结果类似；FMNL2与活性RhoA、RhoC、Rif、Rac1和Cdc42相互作用；FMNL3仅与活性RhoA和Cdc42结合。亚细胞定位分析表明，组成性活性Daam1/2显著富集于极化B16-F1细胞后部收缩性皮层，而活性FMNL2/3同时定位于前端和后部皮层。内源蛋白免疫染色进一步证实了这一分布。RNA-Seq分析显示mDia1、Daam1/2和FMNL2/3在B16-F1细胞中表达水平相当。

Daam1和Daam2的生化特征

单丝TIRF实验表明，Daam1-C和Daam2-C均以浓度依赖方式刺激肌动蛋白成核，Daam2的成核活性约为Daam1的三倍。在profilin存在下，Daam1-C介导的丝延长速率达62.7±4.7亚基/秒，Daam2-C为39.8±3.7亚基/秒，均显著高于对照，表明Daam1是更强的延长因子而Daam2更擅长成核。低转速沉降实验和TIRF实验显示鼠源Daam1-C具有中等程度的丝束化活性，而Daam2-C未检测到束化活性。GST pull-down未检测到Daam1-C与fascin的直接结合。

Rho家族GTPase对Daam1和FMNL2的体外激活

通过共表达Daam1-N和Daam1-C构建自抑制的Daam1三明治复合物。GST pull-down证实活性RhoA-D、Cdc42和Rac1与Daam1-N直接结合，而显性负性变体均不结合。芘标记肌动蛋白聚合实验显示，活性RhoA-D、Cdc42和Rac1均能解除Daam1复合物的自抑制，其中Rac1激活能力最弱。TIRF单丝水平实验进一步证实活性GTPase激活后形成快速生长的暗丝，延长速率约60亚基/秒。FMNL2-N1与活性RhoC、Cdc42、RhoA和Rac1强结合，活性GTPase均能解除FMNL2复合物自抑制，其中Cdc42效果最强。

FMNL2-GTPase相互作用分析

AUC分析表明，含完整FH3结构域的FMNL2-N1形成从二聚体到八聚体的多种寡聚状态，无法定量结合亲和力。使用缺乏部分FH3结构域的较短片段FMNL2-N2（1-379残基）后，测得与Cdc42的K_D≤0.5 μM，与RhoA的K_D为14 μM，与Rac1的K_D≥150 μM。值得注意的是，活性RhoA和Rac1与含完整FH3结构域的较长FMNL2变体结合显著更好，表明FH3结构域对GTPase结合亲和力具有重要影响。

Daam家族成核因子缺失对二维迁移和微刺形成的影响

CRISPR/Cas9依次敲除Daam1和Daam2后，单敲除细胞二维迁移速率明显降低，双敲除进一步加剧迁移缺陷并显著降低均方位移（MSD）。然而，突变细胞仍形成典型的片状伪足和大量微刺，片状伪足F-actin含量、宽度、微刺密度和长度均无显著变化，fascin染色也未见差异，表明Daam1/2不调控指状突起形成。

Daam1/2缺失损害突起持续性

免疫标记显示Arp2/3复合物、WAVE2和VASP在野生型和Daam1/2-KO细胞中的定位和强度几乎一致。FRAP分析显示片状伪足中肌动蛋白网络转运和聚合速率在双敲除细胞中几乎不变。Kymograph分析表明片状伪足突起速率也无显著差异，但突起持续性在Daam1/2-KO细胞中降低约20%，提示迁移缺陷可能源于细胞形态和黏附的间接影响。

Daam缺陷细胞的多前缘表型和黏着斑动力学缺陷

Daam1单敲除细胞中多前缘细胞频率增加，Daam1/2双敲除细胞中这一表型进一步加剧，常同时形成多达五个指向不同方向的片状伪足。突变细胞面积减小至对照的71%-82%，长宽比显著增加，表明极化受损。延时成像显示Daam1/2-KO细胞后部回缩缺陷，常形成异常长的细胞丝状连接最终断裂产生胞质体。黏着斑蛋白（vinculin）标记显示长丝状连接处黏着斑积聚。虽然黏着斑数量、面积和vinculin强度总体无显著变化，但TIRF延时成像和自相关分析表明Daam1/2-KO细胞中黏着斑周转显著减慢，自相关半衰期增加57%，后部黏着斑滑动速度和解聚速率均明显受损，而组装速率不变。

Daam、FMNL和mDia成核因子协同调控皮层刚性和胞质分裂

在Daam1/2-KO细胞中进一步敲除mDia1/3，以及在FMNL2/3-KO细胞中敲除Daam1/2，构建两种四重敲除（4xKO）细胞系。微吸管抽吸实验显示，所有双敲除突变体的初始压入长度（L_p）均增加，两种4xKO细胞进一步增加，其中mDia/Daam 4xKO缺陷最严重。DIC延时成像显示，对照细胞无起泡现象，FMNL2/3-KO细胞仅12%起泡，Daam1/2-KO约三分之一起泡，mDia1/3-KO为46%，FMNL/Daam 4xKO为54%，mDia/Daam 4xKO高达74%。回补实验证实表达EGFP标记的mDia1-FL或Daam1-FL可基本消除mDia/Daam 4xKO的起泡表型，FMNL2-FL或Daam1-FL可回补FMNL/Daam 4xKO的起泡表型。胞质分裂分析显示，双敲除突变体分裂时间仅中度延长，而两种4xKO显著延长，mDia/Daam 4xKO最为严重。中体到细胞核的距离从对照的6.7±2.7 μm逐步增加至FMNL2/3-KO的13.7±7.0 μm、mDia1/3-KO的16.9±11.0 μm、Daam1/2-KO的24.8±17.0 μm、FMNL/Daam 4xKO的30.3±20.9 μm和mDia/Daam 4xKO的35.0±21.6 μm。

四、结论

该研究系统鉴定了B16-F1黑色素瘤细胞中调控收缩性皮层的成核因子谱系，确立了Daam1/2和FMNL2/3作为皮层成核因子的身份，阐明了它们与Rho家族GTPase的相互作用网络和激活机制，揭示了Daam家族成核因子在细胞迁移、极性维持和黏着斑周转中的功能，并证明Daam、FMNL和mDia家族成核因子协同维持皮层完整性、刚性以及胞质分裂的正常进行。这些发现深化了对哺乳动物细胞皮层肌动蛋白组装调控机制的理解，为成核因子家族在细胞力学中的功能分工与协同提供了重要见解。