微生物 d-天冬氨酸（d-Asp）生产研究进展：生物合成、代谢转运、高通量筛选与培养优化

《World Journal of Microbiology and Biotechnology》：Recent progress in microbial production of d -aspartate

　　

d-天冬氨酸（d-Asp）是一种生物活性化合物，参与包括人类在内的动物的神经内分泌调节和生殖功能，实验模型报道其具有组织保护作用，并具有作为药物和功能性食品配料原料的潜在应用。其还用作半合成抗生素的侧链前体。已建立的 d-Asp 工业过程使用固定化微生物细胞酶转化以化学合成的 d,l-天冬氨酸（d,l-Asp）为起始原料，并受限于对化学原料合成的依赖。因此，可持续替代方案受到关注：外源供应的 l-天冬氨酸（l-Asp）的全细胞生物转化已被证明，而从可再生碳源进行的从头生产尚未报道。本小型综述简要指出推动微生物生产的生理和工业背景，然后聚焦于 d-Asp 在微生物中的功能、生物合成、代谢和转运。研究人员进一步讨论基于 d-天冬氨酸氧化酶（d-aspartate oxidase, DDO）的高通量比色法筛选高产 d-Asp 微生物，以及所鉴定菌株的分子和培养特征。这些研究表明，由天冬氨酸消旋酶（aspartate racemase, RacD）介导的消旋化、经 l-天冬酰胺酶（l-asparaginase, AnsA）的前体供应、与双功能天冬氨酸转氨酶（bifunctional aspartate aminotransferase, AspC）相关的竞争代谢，以及培养过程中的 pH 控制影响胞外 d-Asp 积累；膜转运的贡献仍未解决。最后，研究人员强调鉴定 d-Asp 外排泵、生产菌株的代谢工程和培养过程优化是建立可持续且可重复的 d-Asp 发酵平台的关键未来优先事项。

引言
d-氨基酸曾被认作自然界罕见。手性分离和对映选择性分析显示其在哺乳动物、微生物和发酵食品中广泛存在，推动神经科学、微生物学、食品科学和生物技术交叉研究。d-Asp 因神经发育、神经内分泌、生殖功能及精神分裂症关联而受关注；在部分革兰阳性菌中掺入肽聚糖（PG），也是半合成青霉素 aspoxicillin 手性侧链前体。乳酸菌（LAB）发酵被视为潜在生产策略，胞内 d-Asp 形成与胞外积累受 RacD、l-Asp 供应、竞争代谢和膜转运影响。本小型综述聚焦微生物 d-Asp 生产、筛选、分子决定因素和培养，并区分全细胞生物转化与从头发酵。

生理与工业动机
d-Asp 在中枢神经系统（CNS）激活 N-甲基-d-天冬氨酸受体（NMDARs），与长时程增强（LTP）相关，代谢型谷氨酸受体5（mGluR5）参与神经调节。其还影响促黄体生成素（LH）分泌和类固醇生成，支持功能食品和补充剂兴趣，并作为 aspoxicillin 的 d-对映体前体。

工业 d-Asp 生产方法
化学法以马来酸酐或富马酸为原料，经氨加成、酸碱处理和水解得到外消旋 d,l-Asp，需光学拆分；动力学拆分理论产率受50%限制且步骤多。混合法用 N-酰基-d-天冬氨酸酰胺水解酶（d-AAase）选择性水解 d-Asp，但需预 N-酰化并分离。工业代表为固定化 Pseudomonas dacunhae 细胞，利用 l-天冬氨酸 β-脱羧酶（Asd）仅将 l-Asp 脱羧为 l-Ala，d-Asp 不反应；1,000 L 加压柱反应器于1988年工业化，d-Asp 和 l-Ala 产率约86%和70%。限制包括 Asd 产物抑制、固定化细胞活性下降，且仍依赖化学合成 d,l-Asp。

微生物中 d-Asp 的功能
d-Asp 最明确功能是掺入 PG；在部分革兰阳性菌中 d-Asp 或 d-Asn 形成 interpeptide cross-bridge，影响自溶素、抗菌肽敏感性和 β-内酰胺耐药。PG 合成是胞内竞争库。d-Asp 亦可作为环境信号或营养源，Aliivibrio fischeri 的 DarR、Acinetobacter baylyi 的 d-Asp 响应调节协调消旋、转运和分解。LAB 可在发酵食品中积累 d-Asp，但不同菌株、方法和系统发育群差异大；非典型 d-氨基酸影响 PG 重塑或生物膜，但尚不能据此确立 LAB 释放 d-Asp 的内源功能。Thermotoga maritima 中 d-Asp 可能是代谢中间体；Proteobacteria、Campylobacter、蓝细菌和古菌中也存在 d-Asp 相关能力，多为胞内代谢、传感或利用而非胞外积累。

d-Asp 在微生物中的生物合成途径、代谢与转运
主要途径为 RacD 可逆催化 l-Asp 与 d-Asp 互变，其磷酸吡哆醛非依赖，采用双碱机制，两个催化半胱氨酸使构型反转。部分 d-Asp 由 ATP 依赖性 d-天冬氨酸连接酶（AslA）连接至 UDP-MurNAc-五肽，生成含 d-Asp 的 PG 前体，并可经天冬酰胺合酶（AsnH）酰胺化。胞内 d-Asp 分配于 PG 合成、其他代谢和胞外释放，外排机制未明。A. baylyi ADP1 通过 DAACS 家族转运体 AspT、AspY 和 AspS 摄取 d-Asp/l-Asp，RacD 转为 l-Asp，再由天冬氨酸氨裂解酶（AspA）降解为延胡索酸和氨；DarR 与 AalR 调节子重叠。Tetragenococcus halophilus 的 AspT 为电生 Asp:Ala 反向转运体，偶联 l-Asp 脱羧产生质子动力势（PMF），也识别 d-Asp 但速率低。WDN19 含邻近 racD 的 aspT 同源基因和 yveA 同源基因，底物特异性待定。Campylobacter 中 RacD 对 d-Asp/d-Asn 促厌氧生长必需。

高产 d-Asp 分泌乳酸菌的高通量筛选策略
采用 Vanrija humicola UJ1 的 d-天冬氨酸氧化酶（ChDDO）与辣根过氧化物酶（HRP）偶联。ChDDO 将 d-Asp 氧化脱氨，生成 H₂O₂，HRP 与 4-氨基安替比林和 TOOS 产生 λ_max=555 nm 紫色产物，强度与 d-Asp 浓度成比例。流程包括菌株分离、96孔培养、上清初筛、以 OD₆₀₀ 归一化，再用手性高效液相色谱（HPLC）确认 d-Asp 浓度和 d/l-Asp 比，并以16S rRNA 基因鉴定，必要时全基因组测序和平均核苷酸一致性（ANI）分析。对628株食品 LAB 筛得13株产 d-Asp，属 Latilactobacillus、Levilactobacillus、Lactococcus 和 Enterococcus。WDN19 在 MRS 中积累1.84 mM d-Asp，生物量归一化产量高于已知菌株约2.6倍，后鉴定为 Latilactobacillus curvatus，但与 DSM 20019 的 ANI 为98.5%，高产为菌株特异。WDN19 高产与高 racD 转录和 RacD 活性、AnsA 由 l-Asn 供应 l-Asp、aspC 破坏减少竞争消耗有关，外排和调控仍不清。

影响 d-Asp 生产的培养条件
上清 d-Asp 随菌株、培养基、温度、时间和分析方法变化，显示条件依赖但未分离单因素。WDN19 中，25→37 °C 提高生长和 d-Asp 形成速率，37 °C 最佳，40 °C 不生长；37 °C 8 h 后 d-和 l-Asp 约1.5和1.7 mM，d/l 比接近1:1。l-Asp ≤100 mM 对生物量影响小，≥250 mM 抑制生长，500 mM 时生物量约无添加的60%。未缓冲 MRS 中 pH 迅速降至约4.5，活菌数24 h 后近不可检测；30 mM l-Asp 约24 h 达 d/l≈1:1，≥100 mM 未平衡。500 mM MES 维持 pH 约6.0，48 h 后仍保留约35%最大活菌数，500 mM l-Asp 下胞外 d-Asp 超过250 mM，摩尔产率>50%，接近消旋平衡。pH 控制主要通过抑制酸致死延长全细胞消旋。该过程应视为以 l-Asp 为底物的全细胞生物转化，而非从可再生碳源从头发酵。

从头 d-Asp 生产的代谢工程展望
尚未报道代谢工程微生物从头生产 d-Asp。需从可再生碳源供应 l-Asp，经 RacD 转化为 d-Asp，并减少竞争消耗和促进外排。工程 Escherichia coli 可高 l-Asp 通量；Corynebacterium glutamicum 因 PG 为二氨基庚二酸（DAP）型且不掺入 d-Asp，有望减少产物损失。WDN19 的 racD 产物活性高，可导入高 l-Asp 底盘；消耗 l-Asp 的天冬氨酸激酶分支应减弱而非删除。若外排限速，需鉴定偏好 d-Asp 的外排转运体；T. halophilus AspT 对 d-Asp 转运慢，但非已证明外排泵。未来应分别报告 d-Asp 和 l-Asp，并控制 pH 维持活力。

结论与未来展望
微生物中 d-Asp 既是 PG 结构组分，也可为营养源、信号或代谢中间体。胞外积累受 RacD 消旋效率、AnsA 前体供应、AspC 竞争代谢和膜转运影响，后者贡献待功能确立。高通量筛选揭示近缘菌株间差异显著，需菌株水平评价。WDN19 中上述因素协同，pH 控制维持活力对高滴度必需。未来需整合高活性 RacD、前体供应、竞争途径控制和 d-Asp 外排，维持 PG 和细胞壁稳态；结合酶法筛选、手性色谱和比较基因组学发现新菌株。d-Asp 营养和临床应用的功效、剂量和长期安全性仍需研究。