基于计算整合策略阐明乌干达瓦伯格木（Warburgia ugandensis）植物化学物抗结直肠癌的潜在分子机制

《Beni-Suef University Journal of Basic and Applied Sciences》：Computational elucidation of the potential mechanisms of Warburgia ugandensis against colorectal cancer

　　

摘要 背景：结直肠癌（colorectal cancer, CRC）因其高发病率、高死亡率、治疗耐药及治疗相关不良反应，仍是全球重大健康挑战。Warburgia ugandensis 是一种已被证实具有抗结直肠癌活性的药用植物；然而，其具体生物活性化合物及潜在分子机制仍未得到充分探索。本研究采用整合计算策略，探讨 W. ugandensis 植物化学物抗结直肠癌的潜力及其分子机制。 方法：研究人员从已发表文献及天然产物开放收集数据库（Collection of Open Natural Products, COCONUT）中检索植物化学物，经标准化处理后，依据类药性及口服生物利用度进行筛选。预测潜在蛋白靶点并与结直肠癌相关基因取交集，随后开展网络药理学及功能富集分析。采用分子对接、100 ns 分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟、分子力学泊松-玻尔兹曼表面积（molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area, MM-PBSA）结合能计算及吸收、分布、代谢、排泄和毒性（absorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity, ADMET）分析，以评估化合物-靶点相互作用、复合物稳定性及药理学特性。 结果：在鉴定的 242 种植物化学物中，21 种化合物满足类药性及口服生物利用度标准。靶点预测确定了筛选所得植物化学物的 435 个潜在蛋白靶点，其中 411 个与结直肠癌相关基因重叠。对重叠靶点的网络分析确定 PIK3CA、PIK3CD、GNAI1、GNAI3 和 SRC 为关键枢纽基因。功能富集分析提示这些靶点参与癌症相关信号通路，包括磷脂酰肌醇 3-激酶-蛋白激酶 B（phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B, PI3K-AKT）、胰岛素受体及松弛素（relaxin）信号通路。分子对接确定槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）和贝马二烯内酯（bemadienolide）为领先候选化合物，分别对 GNAI1（-9.8 kcal/mol）、GNAI3（-9.6 kcal/mol）和 PIK3CD（-8.7 kcal/mol）具有强结合亲和力。分子动力学模拟表明蛋白-配体复合物在 100 ns 内结构稳定、构象波动降低。结合自由能分析显示有利的相互作用，其中槲皮素-GNAI1 表现出最强的预测结合稳定性（-86.2 ± 3.3 kcal/mol）。药代动力学及毒性预测表明其具有较高的胃肠吸收和总体较低的预测毒性特征。 结论：本研究提供了计算性、假设生成性证据，表明 Warburgia ugandensis 植物化学物可能调控参与结直肠癌的多个分子靶点及信号通路。槲皮素、山柰酚和贝马二烯内酯是值得进一步实验研究的有前景候选化合物。尽管如此，这些预测性发现仍需通过体外和体内研究验证，以确立其治疗相关性。 临床试验编号：不适用。

基于计算整合策略的乌干达瓦伯格木抗结直肠癌分子机制解读

一、研究背景与问题提出

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因，每年新增病例超过180万例，死亡人数逾86万。其发病率和死亡率在不同人群中差异显著，男性发病风险较女性高30%–40%，且全球患病率预计在未来数十年内增长超过60%。生活方式因素如缺乏运动、饮酒、肥胖、红肉或加工肉摄入及吸烟均增加CRC风险，而健康饮食、规律运动和体重控制可将风险降低至37%。

在分子层面，CRC的发生发展涉及多条相互关联的信号通路失调，包括Wnt/β-catenin级联激活导致的细胞增殖失控，PI3K/AKT/mTOR、MAPK/ERK及p53/Bcl-2通路的异常调控所促进的细胞存活与凋亡抵抗，以及TGF-β/SMAD、Notch和JAK/STAT信号驱动的上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）和转移潜能增强。慢性NF-κB和COX-2激活则持续维持炎症、血管生成和肿瘤进展。

当前CRC治疗手段包括手术、放疗、化疗、免疫治疗及靶向治疗（如nivolumab、pembrolizumab、ipilimumab），虽已改善生存，但常受限于系统性毒性、肿瘤异质性、化疗耐药和复发。免疫及靶向治疗仅在特定亚群（如高度微卫星不稳定或错配修复缺陷型肿瘤）中显示获益，多数患者疗效欠佳。因此，亟需能同时调控多条致癌通路的新型、更安全、更有效的干预策略。

Warburgia ugandensis（东非绿心木）属Canellaceae科，长期以来在民间用于治疗感染、炎症、胃肠疾病、风湿、发热、溃疡和呼吸系统疾病。植物化学研究已报道黄酮类、鞣质、倍半萜类和新木脂酰胺类为其主要生物活性成分，可激活CASP9并降低COX-2、5-LOX、Bcl-xL和Bcl-2表达水平，显示抗炎和促凋亡特性。然而，该植物中负责抗CRC效应的具体生物活性化合物及其分子靶点仍未充分阐明。为此，本研究采用整合计算策略，包括网络药理学、生物信息学分析和分子建模，系统探讨该植物的抗CRC潜力及分子机制。

二、研究内容与主要结论

研究人员从文献和天然产物开放收集数据库（COCONUT）中检索到242种W. ugandensis植物化学物，经标准化、去重和规范化后获得89种独特化合物，经类药性（改良Lipinski五规则）和口服生物利用度（Veber规则）筛选后保留21种。靶点预测鉴定出435个潜在蛋白靶点，其中411个与CRC相关基因重叠。蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络分析结合CytoHubba的最大团中心性（Maximal Clique Centrality, MCC）算法，确定PIK3CA、PIK3R1、PIK3CB、PIK3CD、PIK3R2、PIK3R3、SRC、GNAI1、GNAI2和GNAI3为前十位枢纽基因，主要为PI3K信号通路和G蛋白偶联信号组分。功能富集分析显示这些靶点富集于磷脂酰肌醇磷酸生物合成、胰岛素受体信号和PI3K信号等生物学过程，以及脂解调节、血小板活化和松弛素信号等KEGG通路。分子对接发现槲皮素、山柰酚和贝马二烯内酯为领先候选化合物，分别对GNAI1（-9.8 kcal/mol）、GNAI3（-9.6 kcal/mol）和PIK3CD（-8.7 kcal/mol）具有强结合亲和力，显著优于参照化合物5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil, 5-FU）的-4.5至-5.3 kcal/mol。100 ns分子动力学模拟显示所有复合物在约20 ns后达到平衡并保持稳定，配体结合降低了残基灵活性。MM-PBSA结合自由能计算显示槲皮素-GNAI1结合最稳定（-86.2 ± 3.3 kcal/mol），主要由范德华力和静电相互作用驱动。主成分分析（principal component analysis, PCA）显示配体结合使蛋白构象空间受限、结构刚性增强。ADMET预测表明所有化合物具有高胃肠吸收和总体较低的预测毒性，LD50值范围为841至5000 mg/kg，毒性等级为3至5级。

三、关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：从文献及COCONUT数据库检索植物化学物并进行标准化和筛选；利用SwissTargetPrediction预测化合物蛋白靶点，从GeneCards获取CRC相关基因并取交集；通过STRING数据库构建PPI网络，结合Cytoscape的CytoHubba插件进行枢纽基因鉴定；利用SRplot进行基因本体（Gene Ontology, GO）和KEGG通路富集分析；采用AutoDock Vina（PyRx v0.8）进行分子对接并以共结晶配体再对接验证（RMSD ≤ 2.0 ?）；使用GROMACS 2019配合CHARMM36m力场进行100 ns分子动力学模拟；采用gmx_MMPBSA进行MM-PBSA结合自由能计算；利用SwissADME和ProTox-II进行ADMET预测。靶蛋白晶体结构来源于蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB），包括PIK3CD（5DXU）、GNAI1（5JS7）、GNAI3（8OY1）、PIK3CA（7R9V）等。

四、研究结果

4.1 植物化学物检索与筛选：从242种植物化学物中经标准化、去重和规范化获得89种，经类药性和口服生物利用度严格筛选后保留21种化合物，其分子性质满足药物筛选标准。

4.2 靶点预测与CRC重叠：SwissTargetPrediction鉴定出435个潜在靶点，与GeneCards检索的20,094个CRC相关基因取交集后获得411个共同靶点，代表W. ugandensis植物化学物在CRC中的潜在治疗靶点。

4.3 PPI网络与枢纽基因鉴定：411个重叠基因构建的PPI网络包含460个节点和527条高置信度相互作用（评分 ≥ 0.9），CytoHubba MCC算法确定PIK3CA、PIK3R1、PIK3CB、PIK3CD、PIK3R2、PIK3R3、SRC、GNAI1、GNAI2和GNAI3为前十位枢纽基因，主要为PI3K信号通路和G蛋白偶联信号组分。

4.4 功能富集分析：GO富集显示枢纽基因显著富集于磷脂酰肌醇磷酸生物合成、胰岛素受体信号和PI3K信号等生物学过程，定位于外源膜和PI3K复合物，分子功能富集于磷酸肌醇激酶活性。KEGG通路分析鉴定出脂肪细胞脂解调节、血小板活化和松弛素信号等显著通路，以及化学致癌-受体激活通路。

4.5 分子对接结果：21种植物化学物对10个枢纽蛋白的对接显示黄酮类（槲皮素、山柰酚）和drimane型倍半萜类（Dendocarbin A、Dendocarbin L、贝马二烯内酯、Drimenin、Futronolide）结合力强。槲皮素-GNAI1形成氢键、π-阳离子、π-阴离子和π-烷基相互作用，涉及Thr181、Val179、Arg178、Ala326、Glu43、Lys273、Asp150和Asn259等残基。参照化合物5-FU结合力显著较弱（-4.5至-5.3 kcal/mol）。

4.6 分子动力学模拟分析：所有复合物在约20 ns后平衡并保持稳定，未结合蛋白RMSD为0.22–0.25 nm，结合复合物RMSD保持在1.5 nm以下。RMSF分析显示配体结合降低残基灵活性，槲皮素-GNAI1波动最低（0.11 ± 0.07 nm）。Rg值范围为1.75至2.1 nm，表明蛋白结构紧凑。氢键分析显示槲皮素-GNAI1维持3–4个稳定氢键，山柰酚-GNAI3形成2–3个，贝马二烯内酯-PIK3CD最多2个。非键相互作用能计算显示PIK3CD-贝马二烯内酯相互作用最强（-161.2 ± 17.2 kcal·mol?1），主要由范德华力驱动。MM-PBSA分析显示槲皮素-GNAI1总结合自由能最有利（-86.2 ± 3.3 kcal·mol?1），其次为山柰酚-GNAI3（-80.0 ± 3.1 kcal·mol?1）和贝马二烯内酯-PIK3CD（-71.0 ± 2.9 kcal·mol?1）。PCA显示配体结合使构象空间受限，PIK3CD-贝马二烯内酯累计方差贡献最大（69.99%）。

4.7 ADMET分析：所有评估化合物（槲皮素、山柰酚、Dendocarbin A、Dendocarbin L、Isodrimeninol、贝马二烯内酯）均显示高胃肠吸收，血脑屏障通透性和P-糖蛋白底物状态各异。细胞色素P450酶抑制呈选择性，提示潜在药物相互作用。毒性预测显示多数化合物无肝毒性，LD50值841至5000 mg/kg，毒性等级3至5级，总体为低至中度毒性。

五、讨论与结论

讨论总结：本研究通过整合计算策略预测了W. ugandensis植物化学物的抗CRC潜力。鉴定出的21种类药植物化学物以黄酮类（槲皮素、山柰酚）和drimane型倍半萜类为主，两类化合物均已被证实具有抗癌活性，包括诱导程序性细胞死亡、抑制增殖和调节炎症反应。网络药理学分析显示W. ugandensis植物化学物与CRC相关靶点高度重叠，体现了多靶点药理学作用模式。枢纽基因PIK3CA、SRC和GNAI家族是CRC增殖、存活和转移信号的核心调控因子，提示该植物化合物可同时调控多个致癌驱动因素。富集分析揭示的PI3K/AKT信号轴调控可能是其治疗效应的关键机制。此外，血小板活化、松弛素信号和脂肪细胞脂解调节等非经典CRC通路可能反映更广泛的肿瘤促进机制，提示该植物可能不仅靶向原发肿瘤生长，还涉及转移播散过程。ADMET预测支持这些化合物的良好药代动力学特征和低毒性潜力。

结论翻译：本研究提供了计算性、假设生成性证据，表明Warburgia ugandensis植物化学物可能调控参与结直肠癌的多个分子靶点及信号通路。槲皮素、山柰酚和贝马二烯内酯是值得进一步实验研究的有前景候选化合物。尽管如此，这些预测性发现仍需通过体外和体内研究验证，以确立其治疗相关性。临床试验编号：不适用。