循环单核-巨噬细胞极化状态及PD-L1/PD-L2表达在新诊断儿童免疫性血小板减少症中的作用

《Blood Research》：Unveiling the role of circulating monocyte-macrophage polarization state and PD-L1/PD-L2 expression in newly diagnosed pediatric ITP

　　

背景：免疫性血小板减少症是一种由免疫失调和细胞免疫应答改变导致的血小板计数减少的免疫介导性疾病。本研究旨在评估ITP患者单核-巨噬细胞极化模式及免疫检查点分子CD273（PD-L2）和CD274（PD-L1）的表达，并探讨其与血液学参数及糖皮质激素治疗反应的关系。方法：本病例对照研究比较了原发性ITP患者与健康对照组。研究人员采用全血细胞计数评估血液学指标，并通过流式细胞术分析单核-巨噬细胞亚群，包括M1样和M2样群体及其亚型（M2a、M2b和M2c），以及CD273和CD274的表达。结果：与对照组相比，ITP患者的血红蛋白水平、血小板计数和淋巴细胞计数显著降低，而平均血小板体积和血小板分布宽度升高。研究人员观察到ITP患者中M1样单核-巨噬细胞显著增加，同时总M2样细胞减少。在M2亚群中，M2a样细胞增加，而M2b样和M2c样亚群减少。M1样细胞上CD273和CD274的表达降低，且仅M1样和M2a样亚群的CD273表达显著下降，M2b样细胞呈非显著性趋势。与应答者相比，糖皮质激素治疗无应答者表现出更高的M1极化、M2a水平升高、M2b和M2c亚群减少，以及M1和M2a中CD273表达降低。研究发现巨噬细胞样亚群与血小板计数、血红蛋白、MPV和PDW之间存在显著相关性。结论：这些发现表明，促炎性M1样极化转变联合M2b样巨噬细胞上受损的双重PD-L1/PD-L2检查点表达与血小板指数显著相关，并共同促进ITP的免疫发病机制和治疗反应，支持将巨噬细胞极化为一个有前景的免疫调节靶点。

研究背景

免疫性血小板减少症是一种常见的获得性自身免疫性疾病，其特征是由于细胞和体液介导的自体血小板破坏导致外周血血小板计数减少（PLT < 100 × 10⁹/L）。这一过程发生在脾脏，血小板经自身抗体调理后被巨噬细胞吞噬。巨噬细胞在先天性和适应性免疫系统中发挥多重作用，可极化为经典活化的M1样（促炎性）巨噬细胞或替代活化的M2样（抗炎性）巨噬细胞。在ITP中，M1样巨噬细胞在疾病发作时呈现优先倾向，当缓解发生时M1/M2平衡得以恢复。程序性细胞死亡蛋白-1是一种跨膜糖蛋白，主要表达于T细胞（CD4⁺和CD8⁺），与其两个配体CD274和CD273结合后可失活自身反应性T细胞并诱导外周耐受。既往研究表明，ITP中存在巨噬细胞极化失衡和PD-1/PD-L通路失调，但这些免疫改变在急性ITP患儿中的关系尚不清楚。因此，本研究旨在评估儿童急性ITP中循环单核/巨噬细胞样亚群、巨噬细胞极化以及PD-L1/PD-L2的表达。

研究方法与技术

这是一项在Assiut大学儿童医院开展的病例对照研究，共纳入53名儿童，分为32名急性ITP患者组和21名年龄和性别匹配的健康儿童对照组。所有ITP患者均为新诊断并计划接受一线糖皮质激素治疗的1至18岁儿童。研究人员在诊断时、糖皮质激素治疗前采集血样。主要技术方法包括：使用全自动血细胞分析仪进行全血细胞计数以评估血液学指标；采用多色流式细胞术对循环单核-巨噬细胞亚群及其表面PD-L1和PD-L2表达进行定量分析。流式细胞术方案中，研究人员基于CD11b、CD86、CD206和CD163的表面标志物组合定义不同巨噬细胞亚群：M1样为CD86⁺CD11b⁺，M2a样为CD206⁺CD11b⁺CD86^-CD163^-，M2b样为CD86⁺CD206⁺CD11b⁺，M2c样为CD86^-CD163⁺CD206⁺CD11b⁺。随后评估各亚群上PD-L1和PD-L2的表达。数据分析使用R软件4.3.0版本，采用Mann-Whitney U检验比较组间差异，Spearman相关检验分析相关性。

研究结果

外周血血象指标比较： 与健康对照组相比，ITP患者的血红蛋白水平、血小板计数和淋巴细胞计数显著降低，而平均血小板体积和血小板分布宽度显著升高。

单核-巨噬细胞极化向M1样细胞增强分化： 流式细胞术分析显示，ITP组M1样单核-巨噬细胞百分比显著高于对照组（中位数14.4% vs. 3.4%，P < 0.001），而总M2样细胞在ITP组中显著降低（中位数81.6% vs. 92.7%，P < 0.001）。

M2样单核-巨噬细胞亚型极化改变： 在M2亚群中，ITP组的M2a样亚型百分比显著高于对照组（58% vs. 29%，P < 0.001），而M2b样（11% vs. 24%，P < 0.001）和M2c样（7% vs. 38%，P < 0.001）百分比均显著低于对照组。

CD273和CD274在不同巨噬细胞亚群上的差异表达： ITP患者M1样细胞上CD273和CD274的表达均显著降低。在所有M2样亚群中，CD273表达均显著下降：M2a样（中位数6% vs. 25%，P = 0.001）、M2b样（22% vs. 28%，P = 0.02）、M2c样（4% vs. 5%，P = 0.03）。CD274在M2样各亚群上的表达虽有升高趋势但未达统计学显著性。

单核-巨噬细胞表型与糖皮质激素治疗反应的关系： 19例患者治疗无应答，13例达到部分或完全应答。无应答者中M1样极化更高，M2a水平更高，M2b和M2c水平更低。无应答者的CD273⁺ M1和CD273⁺ M2a显著低于应答者，CD273⁺ M2b呈非显著性趋势，CD273⁺ M2c两组间基本一致。

血液学参数与巨噬细胞亚型的相关性： 血小板计数与总M2样巨噬细胞呈正相关，与MPV和PDW呈负相关。CD274⁺ M2b样细胞与血小板计数和血红蛋白水平呈强正相关，与MPV和PDW呈负相关。CD273⁺ M2b样细胞与血小板计数呈强正相关，与MPV和PDW呈负相关。CD274⁺ M1巨噬细胞仅与血小板计数呈适度正相关。

讨论与结论

讨论部分指出，本研究证实了儿童ITP中存在明显的单核-巨噬细胞极化失衡，表现为促炎性M1样细胞占优势而抗炎性M2样细胞减少。这种促炎状态不仅可能增强血小板破坏，还可能干扰巨核细胞成熟。M2a样亚型的升高可能反映了一种代偿性但无效的抗炎反应，而M2c样细胞的减少则提示调节性巨噬细胞功能在ITP中选择性受损。研究还发现，ITP患者M1样细胞上PD-L1和PD-L2均降低，而M2样各亚群仅PD-L2显著降低，这提示PD-L2在M2巨噬细胞的免疫调节中具有重要作用。M2b样巨噬细胞上双重PD-L1/PD-L2检查点的表达与血小板指数密切相关，提示其在维持血液学稳定中发挥核心作用。治疗反应方面，对糖皮质激素应答的患者显示出更明显的抗炎表型倾向，而无应答者则呈现更高的M1极化和更低的M2b/M2c水平，表明巨噬细胞极化方向与治疗反应密切相关。

研究结论：当前研究强调了儿童急性ITP中单核-巨噬细胞极化的促炎性转变，特征为M1样和M2a样占优势，伴随M2b样和M2c样亚群减少。这种失衡伴随着亚群特异性的CD273降低，其中M1样和M2a样细胞最为显著。尽管CD274在M2b样巨噬细胞上的表达在患者与对照组间无显著差异，但在患者组内，CD274⁺ M2b样细胞与血小板计数和血小板指数的相关性最强，将该检查点与整体血液学稳定性联系起来而非孤立的表达缺陷。增强的M2c样极化与糖皮质激素应答性相关，进一步强调了巨噬细胞表型分析在ITP中的治疗相关性。这些发现支持将巨噬细胞极化和PD-L1/PD-L2检查点表达作为有前景的免疫调节靶点，有待在更大规模的前瞻性研究中进一步进行功能性验证。