血浆趋化因子CXCL10与卒中发病风险：来自北曼哈顿研究的14年前瞻性队列证据

《Translational Stroke Research》：Chemokine CXCL10 and Incident Stroke Risk in the Northern Manhattan Study

　　

摘要专业翻译 炎症 contributes to 脑血管疾病（cerebrovascular disease），但针对广泛免疫标志物panel与卒中发病的前瞻性研究仍有限。本研究旨在识别与卒中发病独立相关的血浆免疫标志物。北曼哈顿研究（Northern Manhattan Study，NOMAS）中无卒中病史、年龄≥50岁的参与者，通过Luminex技术检测了60种血浆免疫相关蛋白。采用最小绝对收缩与选择算子（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）Cox回归筛选与全因卒中发病相关的标志物。入选标志物依次在调整血管风险、心脏合并症、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白质高信号体积（white matter hyperintensity volume，WMHV）的Cox模型中进行检验。缺血性卒中作为次要结局，并通过bootstrap重抽样进行内部验证。在1175名参与者中（平均年龄70±9岁；60%为女性；67%为西班牙裔），中位随访14年间共发生130例卒中，其中101例（78%）为缺血性卒中。LASSO仅筛选出C-X-C基序趋化因子配体9和10（CXCL9和CXCL10）。在调整血管风险、心脏合并症及炎症细胞因子后，CXCL10每增加1个标准差与全因卒中风险增加20%相关（HR 1.20；95%CI 1.04–1.38）。该关联在进一步调整WMHV后仍然存在（HR 1.18；95%CI 1.02–1.37），在缺血性卒中中结果相似（HR 1.19；95%CI 1.01–1.41），并在bootstrap重抽样中保持稳定。CXCL9与卒中无独立关联。在一个多民族城市老龄化队列中经过十余年前瞻性随访，基线血浆CXCL10（又称干扰素-γ诱导蛋白10，interferon-γ–induced protein 10，IP-10）与卒中发病独立相关。CXCL10可能标志着与脑血管脆弱性相关的干扰素-γ应答性免疫活性。CXCL10是否提示一条可干预的卒中预防通路值得进一步研究。

论文解读

一、研究背景与问题

卒中是全球范围内导致死亡和长期残疾的主要原因之一。尽管传统危险因素如年龄、血压、糖尿病、吸烟和心房颤动等已纳入成熟的卒中风险预测工具，但仅基于这些因素的风险预测仍不完整，提示尚有其他生物学通路参与卒中易感性。炎症已被公认为脑血管疾病的关键机制，但如何在临床上可操作地捕捉炎症生物学仍不确定。既往关于循环炎症标志物与卒中风险的前瞻性研究多集中于少数候选标志物，最常见的是超敏C反应蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hsCRP）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）。近年来，大规模蛋白质组学平台已在社区队列中识别出与卒中发病可重复相关的蛋白，但这类平台同时检测数百至数千种蛋白，施加了严格的统计学阈值，效应量适中的免疫介质可能无法跨越该阈值。因此，与卒中风险相关的免疫通路仍未被充分刻画。聚焦免疫谱的检测可降低多重检验负担，结合有原则的数据降维方法，能够识别既具有生物学可解释性又具有临床可操作性的标志物。北曼哈顿研究（Northern Manhattan Study，NOMAS）是一个表型完善的前瞻性队列，随访超过二十年，最初旨在研究美国多民族都市人群中的卒中发病率和危险因素。既往针对卒中发病的蛋白质组学研究主要在欧洲队列及美国白人和黑人队列中进行，西班牙裔成年人的代表性有限。因此，在具有大量西班牙裔代表的多民族队列中进行免疫聚焦分析尚属空白。研究人员假设，涵盖炎症、调节和凝血相关通路的广泛循环免疫相关蛋白panel能够识别与全因卒中发病独立相关的标志物。

二、研究设计与主要结论

研究人员利用NOMAS中2003至2008年间纳入MRI子研究的参与者作为分析样本，共1175名无卒中病史、年龄≥50岁的参与者纳入最终分析。基线时通过定制的60重磁珠免疫分析（Luminex 200?平台）检测60种血浆免疫相关蛋白。卒中事件通过年度电话随访结合医院监测系统确认，由两名神经科医生独立分类，第三名神经科医生解决分歧。中位随访14年期间共发生130例卒中，其中101例（78%）为缺血性卒中。采用最小绝对收缩与选择算子（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）Cox回归从60种免疫标志物中筛选与全因卒中相关的标志物，最终仅筛选出C-X-C基序趋化因子配体9和10（CXCL9和CXCL10）。在依次调整年龄、性别、种族民族、全球血管风险评分（global vascular risk score，GVRS）、心脏合并症（心房颤动、心肌梗死、充血性心力衰竭）、炎症细胞因子（IL-6、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α）及白质高信号体积（white matter hyperintensity volume，WMHV）后，CXCL10每增加1个标准差与全因卒中风险增加20%相关（HR 1.20；95%CI 1.04–1.38），该关联在缺血性卒中中保持一致（HR 1.19；95%CI 1.01–1.41），并在2000次bootstrap重抽样中保持稳定。CXCL9在调整后与卒中无独立关联。该研究的重要意义在于，在多民族城市老龄化队列中，基线血浆CXCL10与卒中发病独立相关，提示这一干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）诱导的趋化因子可能捕捉了传统血管危险因素无法解释的免疫血管脆弱性维度，为卒中预防提供了潜在的可干预新靶点。

三、关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：第一，基于Luminex 200?平台的定制60重磁珠免疫分析，检测60种血浆免疫相关蛋白，使用中位荧光强度（median fluorescence intensity，MFI）而非推算浓度进行分析以避免标准曲线外推偏差；第二，LASSO Cox回归作为数据降维和标志物筛选方法，通过五折交叉验证选择惩罚参数；第三，Cox比例风险模型进行多模型序贯调整以检验独立关联；第四，bootstrap重抽样（2000次迭代）进行内部验证，评估标志物选择和效应估计的稳定性；第五，Kaplan-Meier生存分析和log-rank检验比较不同趋化因子水平的卒中累积发生率；第六，模型区分度和重分类指标评估（Harrell's C-index、时间依赖性AUC、净重分类改善指数）检验CXCL10的增量预测价值。样本队列来源于北曼哈顿研究（NOMAS）MRI子研究，该队列通过随机数字拨号招募纽约市北曼哈顿地区居民。

四、研究结果

LASSO筛选结果：在60种免疫标志物中，LASSO仅选择CXCL9和CXCL10，其余所有系数均收缩为零。在2000次bootstrap重抽样中重复整个LASSO程序，CXCL10是60种标志物中被选择频率最高的（76%的重抽样），CXCL9在55%的重抽样中被选择。

生存分析结果：Kaplan-Meier分析显示，CXCL9或CXCL10高于中位数的参与者卒中累积发生率更高（log-rank p=0.002和p=0.015）。卒中发生率在CXCL9四分位数间存在差异（log-rank p=0.004），较高四分位数的无卒中生存期逐渐缩短，但CXCL10四分位数间差异未达统计学显著（log-rank p=0.11）。

相关性分析结果：CXCL9与年龄（ρ=0.32）和GVRS（ρ=0.25）的相关性强于CXCL10（分别为ρ=0.14和ρ=0.09）。CXCL9与CXCL10之间呈中度相关（Spearman ρ=0.63；95%CI 0.59–0.66），而两种趋化因子与IL-6、IL-1β、TNF-α、hsCRP和WMHV的相关性均较弱（所有|ρ|≤0.22）。人口学、临床、肾脏和影像危险因素合计仅解释循环CXCL10方差的5.3%，没有任何单一因素解释超过1.1%。

多变量Cox回归结果：每1个标准差增加的CXCL10在调整GVRS和心脏合并症后与全因卒中风险增加21%相关（HR 1.21；95%CI 1.06–1.39），进一步调整IL-6、IL-1β和TNF-α后仍显著（HR 1.20；95%CI 1.04–1.38），调整WMHV后依然存在（HR 1.18；95%CI 1.02–1.37）。CXCL9在任何模型中均与全因或缺血性卒中无关。当两种趋化因子同时进入模型时，CXCL10仍与卒中相关（HR 1.20；95%CI 1.03–1.40），CXCL9则无关联（HR 0.98；95%CI 0.78–1.24）。限制性立方样条分析支持两种趋化因子与卒中的关联近似线性，无阈值效应证据。

敏感性分析结果：CXCL10与缺血性卒中的关联一致（HR 1.19；95%CI 1.01–1.41），额外调整估算肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）后关联仍存在（HR 1.21；95%CI 1.04–1.40），在718名有hsCRP数据的参与者中额外调整hsCRP后关联依然显著（HR 1.19；95%CI 1.07–1.33）。排除随访第一年内卒中后关联仍存在（121例事件；HR 1.17；95%CI 1.001–1.36），但排除前两年后不再显著（113例事件；HR 1.12；95%CI 0.94–1.33），可能反映事件数减少导致的统计效能下降。

内部验证结果：2000次bootstrap重抽样中，CXCL10的全因卒中HR保持稳定（中位HR 1.18；95%百分位区间1.001–1.35），CXCL9无一致关联（中位HR 1.07；95%百分位区间0.84–1.20）。在60种标志物的单独人口学调整模型中，CXCL10具有最大的HR且是唯一名义p<0.05的标志物（HR 1.19；p=0.017），但经Benjamini-Hochberg错误发现率（false discovery rate，FDR）校正后不再显著（q=0.90）。

预测价值评估结果：将CXCL10加入临床-炎症基础模型后改善了模型拟合（似然比χ2=5.39，df=1，p=0.020）。Harrell's C指数从0.687增至0.696，时间依赖性AUC在5年、10年和14年分别从0.675增至0.688、从0.738增至0.751、从0.741增至0.748。10年时连续净重分类改善指数为0.115（95%CI ?0.020至0.239；p=0.090），综合判别改善指数为0.0048（95%CI ?0.0017至0.0187；p=0.178），均未达统计学显著。

五、讨论与结论总结

讨论部分指出，CXCL10与卒中的关联独立于血管危险因素、心脏合并症、已确立的炎症标志物、肾功能和WMHV，且该关联在缺血性卒中中一致。遗传学证据支持CXCL10在脑血管疾病中的潜在因果作用：一项涉及50余万人的蛋白质基因组学分析发现，CXCL10是受IL-6信号影响的唯一与动脉粥样硬化疾病相关的蛋白；一项孟德尔随机化研究将基因预测的CXCL10与缺血性卒中和脑出血均相关联。PRIME研究（随访9771名健康中年欧洲男性10年）也发现基线CXCL10与缺血性卒中独立相关。CXCL10可能通过C-X-C基序趋化因子受体3（C-X-C motif chemokine receptor 3，CXCR3）信号通路发挥作用，该受体表达于免疫细胞、血管细胞和中枢神经系统细胞，参与T细胞迁移、慢性炎症、内皮激活和血栓-炎症相互作用。尽管CXCL9和CXCL10共享受体且常共表达，但二者在组织表达、受体结合和下游效应方面存在差异，这可能解释了CXCL10在调整CXCL9后仍保留独立关联。CXCL9与年龄和GVRS相关性更强，可能反映与衰老相关的慢性小血管损伤而非促发卒中的过程。CXCL10与卒中的关联近似线性，提示降低CXCL10水平可能具有保护作用。抗炎治疗（如卡纳基单抗和秋水仙碱）已证明炎症通路是心血管风险的可修饰因素，CXCL10本身可能具有药理学可修饰性：过氧化物酶体增殖物激活受体-γ激动剂可抑制其在人内皮细胞中的表达，阿托伐他汀可降低循环CXCL10水平。针对CXCL10的单克隆抗体已在免疫介导疾病中进行测试，但其与卒中预防的相关性尚不清楚。研究局限性包括：单次生物标志物测量无法区分稳定与瞬时免疫激活、出血性和缺血性亚型事件数较少限制亚型分析、标志物选择与假设检验在同一数据集进行、60种标志物筛查中CXCL10关联未通过多重检验校正等。研究结论为：在多民族城市队列中随访十余年，循环CXCL10水平升高与卒中发病相关，该关联独立于已确立的血管危险因素、心脏合并症、常用炎症细胞因子、肾功能和WMHV。CXCL10是60种免疫标志物中在bootstrap重抽样中最常被选择的标志物，其与卒中的关联与独立人群中的前瞻性和遗传学证据一致。这一IFN-γ诱导的趋化因子可能捕捉了血管负荷无法解释的脑血管脆弱性的免疫血管维度。外部复制及CXCL10与血管和影像表型的整合是下一步工作。由于CXCL10可在血浆中测量且具有潜在可修饰性，靶向IFN-γ应答性趋化因子信号通路可能为降低卒中风险和维持血管脑健康提供新途径。