《Discover Plants》：Clean gene technology for precision breeding and genetic improvement of vegetable crops
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全球范围内，由于人口增长和健康意识的提升，蔬菜生产需求正在加速增长。尽管传统植物育种在蔬菜生产中取得了成功，但该方法耗时且受限于有性亲和性。转基因技术的出现提供了突破，但由于选择标记基因（SMGs）和外源DNA的存在，该技术遭遇了重大的公众和监管挑战。因此，洁
全球范围内，由于人口增长和健康意识的提升，蔬菜生产需求正在加速增长。尽管传统植物育种在蔬菜生产中取得了成功，但该方法耗时且受限于有性亲和性。转基因技术的出现提供了突破，但由于选择标记基因（SMGs）和外源DNA的存在，该技术遭遇了重大的公众和监管挑战。因此，洁净基因技术（clean gene technology）或无标记转化（marker-free transformation）一词应运而生，用以描述一系列旨在生产不含选择标记基因和外源DNA的转基因（GM）植物的先进分子方法。洁净基因技术提供了一种根本性的选择方案，其包括CRISPR-Cas和寡核苷酸定向诱变（ODM）等方法。这些技术能够在最终产品中不引入外源DNA的情况下，实现对植物基因组的靶向、精准改变。本文总结了洁净基因技术的概念、主要方法（位点特异性重组、转座子系统、基因组编辑），并综述了该技术在改良蔬菜作物关键性状（如产量、品质、抗病性、非生物胁迫耐受性）方面的基本原理、应用及未来机遇，同时探讨了相关的监管和社会环境。
论文主体内容总结
1 引言
现代农业生物技术的兴起为改良作物性状带来了前所未有的机遇，涵盖提高产量、营养价值以及赋予作物对多种生物和非生物胁迫的抗性。传统转基因（GM）技术虽然具有开创性，但通常涉及外源DNA的稳定整合，不仅包括目的基因（GOI），还包括选择标记基因（SMGs）。这些SMGs对于实验室筛选过程中识别成功转化的植物细胞至关重要，但其在最终作物产品中的持续存在引发了公众忧虑和复杂的监管争论，涉及潜在的环境影响，如抗性基因向微生物的水平转移，以及消费者接受度问题。蔬菜是人类均衡饮食不可或缺的组成部分，提供必需的维生素、矿物质、抗氧化剂和膳食纤维。然而，气候变化加剧的生物和非生物胁迫持续威胁着蔬菜生产。传统育种仍是作物改良的基础，但该工作耗时长、进展缓慢，且受内在遗传障碍的限制。
二十世纪最后二十五年重组DNA技术的发展使得基因跨物种直接转移成为可能，通过转基因作物创造了新品种。然而，第一代GM作物中使用的选择标记主要涉及抗生素或除草剂抗性基因，这些标记基因残留在商业产品中，引发了对水平基因转移、致敏性和环境影响的担忧。这些安全担忧虽然在科学严谨性上大多未被证实，却仍对公众怀疑论和严格监管标准的实施产生了深远影响。为应对这些挑战，植物生物技术领域显著发展，催生了“洁净基因技术”。该技术涵盖多种策略，旨在生产不含选择标记基因的转基因植物，从而解决公众和监管方面的关切。其将焦点从单纯引入新性状转向开发无标记转基因植物——即仅含有预期遗传修饰、不含SMGs或载体骨架序列等多余DNA序列的作物。洁净基因技术的本质在于其对精准性和生物安全性的承诺，旨在培育出与传统育种品种几乎无法区分、仅具有特定有益性状的遗传改良品种。
2 什么是洁净基因技术？
洁净基因技术正是直接源于上述问题而发展起来的。其最终目标是将所需性状，即所谓的“洁净基因”，在不附加DNA（如选择标记基因或载体骨架序列）的情况下转入植物基因组。因此，成品植物仅针对目标农业性状进行遗传修饰，除功能性增强外，与传统育种方法产生的植物无法区分。洁净基因技术，又称无标记转基因技术或精准基因组编辑，是指旨在将有益性状引入植物而不遗留不良遗传元件的先进基因工程方法。
2.1 洁净基因技术的关键原理与方法
核心原理是确保最终转基因植物仅含有目标性状基因，不含任何多余DNA。为实现这一目标，已开发出多种策略：
2.1.1 共转化（Co-transformation）：该方法使用两个独立的DNA质粒：一个携带目的基因，另一个携带选择标记基因。质粒同时导入植物基因组。其原理是，在后续世代中，目的基因和选择标记基因根据孟德尔定律独立分离，从而可筛选出仅继承目的基因而不含选择标记基因的后代。该方法已在甘蓝和番茄上成功应用。
2.1.2 位点特异性重组系统（如Cre-loxP、FLP-FRT）：这些系统利用重组酶（如Cre或FLP）识别特定DNA序列（分别为loxP或FRT位点）。这些识别位点侧翼连接选择标记基因。成功转化和筛选后，激活重组酶基因（通常受组织特异性或诱导型启动子控制），导致选择标记基因被切除。重组酶基因本身可在后续世代中分离出去或自动切除。
2.1.3 转座子介导的切除：转座子（可移动遗传元件）可被改造以携带选择标记基因。植物转化后，转座子可“跳出”基因组，带走选择标记基因，仅留下目的基因。源自玉米的Ac/Ds（Activator/Dissociation）系统最近已成功用于莴苣等蔬菜。
2.1.4 靶向基因替换/基因组编辑（CRISPR-Cas9、TALENs和ZFNs）：这些革命性技术允许对植物基因组进行高度精准的修饰。基因编辑工具不是随机插入外源DNA，而是能在预定位置直接修饰、删除或插入特定序列。这通常完全避免了选择标记的需求，或允许其临时使用并在后续精准移除。CRISPR/Cas9系统的发展彻底革新了洁净基因技术领域，其能够实现精准的基因组修饰，如基因敲除、碱基编辑和在预定插入位点插入基因。其优势在于可在单代内产生无转基因的编辑植物。通过瞬时核糖核蛋白复合物递送CRISPR试剂，或在T1代中分离Cas9/sgRNA转基因，可获得无残留编辑机制的预期编辑植物。这一技术在番茄中已得到显著验证，实现了果实增大和株型改良。
3 洁净基因技术在蔬菜作物中的应用
洁净基因技术在蔬菜中的目标是在不引入多余DNA（特别是传统遗传修饰中常用的选择标记基因）的情况下引入理想性状，旨在提高公众接受度并简化监管流程。
3.1 抗病性
3.1.1 番茄（番茄黄化曲叶病毒-TYLCV）：传统GM方法引入抗性基因（如病毒外壳蛋白基因或RNA干扰构建体）并伴随SMG。洁净基因方法可采用共转化策略，使用两个独立质粒分别携带TYLCV抗性基因和SMG，通过后代独立分离筛选无标记植株。也可采用CRISPR-Cas9精准编辑策略，修改番茄中原本使其易感TYLCV的基因，如敲除或修饰eIF4E基因家族成员等宿主易感基因以赋予抗性。若使用瞬时CRISPR系统递送，最终编辑植物中不会残留外源DNA或SMG。
3.1.2 马铃薯（由致病疫霉引起的晚疫病）：传统方法从野生马铃薯近缘种引入抗性（R）基因并伴随SMG。洁净基因方法可采用Cre-loxP位点特异性重组系统，将R基因插入侧翼为loxP位点的SMG中，筛选后激活Cre重组酶切除SMG，最终植株仅含R基因。也可采用CRISPR-Cas9进行顺基因插入或编辑，将天然马铃薯R基因精准插入预定安全港位点，无需随机插入或SMG。
3.1.3 黄瓜：利用CRISPR/Cas9基因编辑eIF4E基因，赋予对马铃薯Y病毒（PVY）等马铃薯Y病毒属病毒的广谱抗性。eIF4E作为易感因子发挥作用，病毒VPg蛋白附着于eIF4E，劫持植物翻译机制，破坏该连接可抑制病毒繁殖。
3.1.4 番茄和辣椒：辣椒Bs2基因（赋予细菌性斑点病抗性）已通过无标记载体转入番茄，显示出持久抗性。
3.2 抗虫性
3.2.1 茄子（果实和嫩茎螟虫-EFSB）：传统GM方法从苏云金芽孢杆菌（Bt）引入合成cry基因并伴随SMG。洁净基因方法可采用转座子介导的切除，将Bt cry基因插入，SMG由转座元件携带，筛选后转座元件“跳出”基因组，仅留下Bt cry基因。也可采用基于基因编辑的RNA干扰方法，利用CRISPR精准插入发夹RNA构建体，当EFSB取食植物时沉默其关键基因。
3.3 非生物胁迫耐受性
3.3.1 甜椒/番茄（盐胁迫）：传统方法引入离子转运相关基因（如来自拟南芥的NHX1反向转运蛋白）或渗透调节基因（如脯氨酸合成相关P5CS基因）并伴随SMG。洁净基因方法可采用共转化或位点特异性重组去除SMG。甘蓝型油菜是洁净基因策略的典型例子，研究人员利用农杆菌引入两个独立T-DNA，分别携带目标基因和选择标记，分离后获得仅含目标基因的植株。也可采用CRISPR-Cas9对天然基因进行修饰，如增强天然盐耐受相关基因的表达或敲除盐耐受负调控因子。
3.3.2 葫芦科作物（黄瓜、甜瓜-干旱胁迫）：研究表明CRISPR/Cas9可通过精准改变天然胁迫响应基因来提高黄瓜耐旱性。研究强调编辑CsNAC和CsDREB等转录因子，其调控下游干旱响应通路，从而增强水分保持能力并减少胁迫期间萎蔫。
3.3.3 番茄：研究已证实下调SIMAPK3（一种丝裂原活化蛋白激酶基因）的表达可通过修饰胁迫信号通路增强番茄在水分亏缺和盐胁迫条件下的恢复力。早期研究表明过表达CBF1（C-重复结合因子1）可提高番茄耐冷性并减少冷诱导损伤。现代CRISPR介导的胁迫通路微调方法，如精准编辑MAPKs、CBFs和水通道蛋白基因，代表了改善番茄非生物胁迫耐受性的无标记洁净基因方法。
3.3.4 马铃薯：通过过表达胞质抗坏血酸过氧化物酶以改善氧化胁迫耐受性已获成功。
3.4 改善营养含量（生物强化）
3.4.1 胡萝卜（增强β-胡萝卜素以获取维生素A）：传统方法引入类胡萝卜素生物合成通路基因（如水仙Psy基因、细菌CrtI基因）并伴随SMG。洁净基因方法可采用CRISPR进行无标记整合，将所需类胡萝卜素生物合成基因精准插入胡萝卜基因组“安全港”位点，CRISPR组分可通过核糖核蛋白复合物瞬时递送，不整合入基因组。也可采用CRISPR增强天然类胡萝卜素通路基因表达，如修饰启动子或敲除类胡萝卜素积累负调控因子。
3.4.2 菠菜/豆类（增强铁或锌含量）：研究表明编辑ZIP（锌调控转运蛋白/铁调控转运蛋白样蛋白）和NRAMP（天然抗性相关巨噬细胞蛋白）等天然转运蛋白基因可改善菠菜叶片中铁和锌的吸收与积累。CRISPR/Cas9还可修饰铁蛋白基因（对铁储存至关重要）和金属转运蛋白基因以提高种子微量元素水平。对ZIP和YSL（黄色条纹样转运蛋白）通路的CRISPR介导调控可大幅增加豆类种子中锌的积累。
3.5 增强品质性状
3.5.1 马铃薯（抗褐变、减少丙烯酰胺前体）：传统方法利用RNAi沉默编码多酚氧化酶（PPO）的基因以阻止褐变，沉默天冬酰胺合成相关基因以减少丙烯酰胺形成。洁净基因方法采用CRISPR-Cas9精准敲除或破坏PPO活性或天冬酰胺合成酶相关基因，由于是精准删除或突变，最终马铃薯植株无需整合外源DNA或SMG。
3.5.2 马铃薯：利用Affymetrix辅助的等位基因特异性编辑（ASBE）实验开发无直链淀粉马铃薯，显示出改善的烹饪品质和对丙烯酰胺形成的耐受性。
3.5.3 番茄：CRISPR可用于修饰果实成熟相关基因（如RIN、CNR、NOR基因），在不负面影响风味的情况下延长货架期。通过编辑SIAGO7基因，番茄红素含量提高300%。无标记系统已进一步用于增加叶酸积累和花青素积累。日本利用CRISPR/Cas9开发了全球首个富含γ-氨基丁酸（GABA）的番茄，英国也利用CRISPR/Cas9开发了富含维生素D的番茄。
3.6 提高产量
传统GM方法引入增强光合效率、养分吸收或开花时间调控的基因并伴随SMG。洁净基因方法采用CRISPR-Cas9优化天然产量相关基因，如植物株型相关基因（分枝模式、株高）、养分利用效率基因（氮或磷利用）或光合通路基因。这些编辑通常是精准的，往往敲除负调控因子或增强正调控因子，从而实现无标记的产量改良。
4 生物安全、监管与公众认知
标记基因和载体骨架序列的存在显著加剧了人们对GM作物想象中及部分真实风险的担忧。洁净基因技术可替代外源DNA，且顺基因和种内基因方法结合“外源”遗传物质相关的风险在某些司法管辖区可能受到较宽松的监管分析。在美国、日本和阿根廷等许多国家和地区，基因组编辑的无转基因作物目前按照与传统作物制度相当的规定进行监管。这种监管一致性是加速改良蔬菜品种商业化的重要前提。
4.1 洁净基因技术的优势
通过去除抗生素抗性基因等外源DNA序列，洁净基因产品被认为更安全、更“天然”，可能缓解监管障碍并增强消费者对GM作物的信心。该技术最大限度降低了标记基因向其他生物或环境意外水平转移的风险。由于缺乏“不必要”的外源DNA，洁净基因技术开发的产品可能面临较不严格的监管审查。尤其是基因组编辑工具，该技术能够实现精准、靶向的修饰，减少脱靶效应并实现性状微调。其可应用于广泛的蔬菜作物，包括基因组复杂或难以传统育种的品种。通过减少农药需求并可能实现边缘环境栽培，该技术有助于更可持续的农业实践。
4.2 挑战与考量
尽管前景广阔，洁净基因技术仍面临若干挑战：实现100%无标记植物仍具挑战性且劳动密集，需大量后代筛选；基因编辑和洁净基因作物的监管环境仍在演变，各国差异显著，部分地区仍将基因编辑作物归类为GMO；先进基因编辑技术成本高昂且需专业知识，可能限制小型研究机构或发展中国家的获取；基因编辑虽精准，但仍可能发生脱靶修饰，需严格验证和筛选；尽管具有“洁净”特性，公众对遗传修饰的怀疑仍存在，需透明沟通和教育；基因编辑工具和洁净基因构建体的专利格局复杂，影响商业化。
4.3 近期进展与未来前景
CRISPR-Cas9递送方法和特异性方面的持续改进使得在多种蔬菜作物中更易、更高效地产生精准无标记编辑。除CRISPR外，正在探索新系统以提供更高精度、更少脱靶效应和不同作用模式。植物转化方案的优化对于将洁净基因构建体高效递送至顽固蔬菜物种至关重要。将传统育种与靶向基因编辑相结合可加速改良蔬菜品种的开发。研究日益聚焦于直接惠及消费者的性状，如增强风味、延长货架期和改善营养特性，这可能进一步推动公众接受。
5 结论
洁净基因技术已从理想概念发展为重新定义蔬菜作物改良面貌的实用工具库。通过消除第一代GM作物的基本技术和社政劣势，该技术是迈向可持续农业新阶段的一步。利用CRISPR-Cas等高精度技术与精密转化方案相结合，将加速营养强化、气候耐受和高产蔬菜品种的开发。随着全球粮食和营养安全持续受到关注，洁净基因技术将成为实现这一愿景的核心解决方案。洁净基因技术是加速蔬菜作物遗传改良的有力且精准的工具库，可在不使用外源DNA的情况下实现靶向修饰，有助于解决第一代GMO相关的诸多问题。在番茄、马铃薯、黄瓜等作物上展示的产量、品质、抗病性和胁迫耐受性应用仅是冰山一角。在理想的监管框架和日益增长的公众接受度支持下，洁净基因技术可在未来提供可持续、高产且营养丰富的食品供应中发挥核心作用。
