中国东北地区腹泻梅花鹿仔鹿源多重耐药 *Proteus mirabilis* 的分离鉴定、毒力-耐药特征、生物被膜及全基因组致病性研究

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Isolation and characterization of multidrug-resistant Proteus mirabilis from diarrheic sika deer fawns in Northeast China

　　

梅花鹿仔鹿腹泻是一种多因素疾病，严重影响中国鹿业发展。在本研究中，研究人员聚焦于2022至2024年自黑龙江、吉林和辽宁三省腹泻梅花鹿仔鹿中分离的 *Proteus mirabilis*。共计75株 *P. mirabilis* 通过菌落形态、革兰染色、16S rRNA 基因测序、包含模式株的系统发育分析以及作为补充分子检测的 atpD 基因靶向 PCR 鉴定。采用 PCR 检测毒力基因和抗菌药物耐药（antimicrobial resistance, AMR）基因，使用肉汤微量稀释法测定抗菌药物敏感性，并通过结晶紫染色评估生物被膜（biofilm）形成。进一步利用小鼠口服灌胃（oral gavage）和腹腔攻击（intraperitoneal challenge）模型评估代表性分离株的致病潜力，随后观察临床症状并对心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏进行组织病理学检查。分离株携带多种毒力基因和 AMR 基因，表现出多重耐药（multidrug-resistant, MDR）表型，并显示中等至强生物被膜形成能力。口服灌胃代表性分离株在两天内诱导小鼠出现明显腹泻，而腹腔攻击导致临床症状、死亡和多器官组织病理学损伤。主要攻击株 Y24N1546 的全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）获得一条 4,073,229 bp 的环状染色体。与 *P. mirabilis* 模式株 ATCC 29906^T 进行全基因组比较，平均核苷酸一致性（average nucleotide identity, ANI）为98.94%，数字DNA-DNA杂交（digital DNA-DNA hybridization, dDDH）值为93.4%；独立 TYGS（Type (Strain) Genome Server）分析也将 Y24N1546 归属于 *P. mirabilis*。总体而言，这些发现支持 *P. mirabilis* 是与中国东北地区腹泻梅花鹿仔鹿相关的重要细菌病原体。由于仔鹿腹泻是多因素的，*P. mirabilis* 的病因学贡献应结合其他宿主、环境和管理相关因素进行解释。

论文主体部分解读如下。

研究背景方面，梅花鹿仔鹿腹泻是一种复杂的多因素疾病，细菌病原体可在其中作出重要贡献。中国东北曾从养殖腹泻梅花鹿中分离到致病性和多重耐药 *Escherichia coli*。研究人员的宏基因组分析显示，健康和腹泻梅花鹿仔鹿粪便微生物组成不同，腹泻动物中包括 *Escherichia coli* 和 *Proteus mirabilis* 在内的潜在细菌病原体丰度增加。*P. mirabilis* 是肠杆菌科革兰阴性机会致病菌，具有临床和兽医意义，可感染人及牛、犬、家禽和毛皮动物等，引起泌尿、呼吸、伤口和消化道感染。其可携带多种毒力决定因子、形成生物被膜并获得 AMR 基因，可能增加养殖环境持续存在并降低治疗效果。既往不同国家和宿主的研究已描述人、犬、家禽、牛等来源 *P. mirabilis* 的耐药、毒力、生物被膜和基因组特征，但鹿源 *P. mirabilis* 尤其在仔鹿腹泻方面仍缺乏系统表征。研究人员在腹泻仔鹿粪样细菌学检查中反复回收 *P. mirabilis*，结合东北腹泻动物中 *P. mirabilis* 的既往报道，因而系统表征这些鹿源分离株，并用小鼠攻击模型评估代表性分离株的致病潜力。该研究旨在从中国东北腹泻梅花鹿仔鹿中分离并表征 *P. mirabilis*，聚焦分子鉴定、毒力和 AMR 基因谱、抗菌药物敏感性、生物被膜形成以及小鼠口服灌胃和腹腔攻击模型中的致病性。

开展研究后，研究人员共鉴定75株非重复 *P. mirabilis*，其携带多种毒力和 AMR 基因，呈 MDR 表型并具有中等至强生物被膜形成能力。代表株在口服灌胃后诱导小鼠腹泻，在腹腔攻击后引起临床症状、死亡和多器官组织病理学病变。主要攻击株 Y24N1546 经全基因组分析确认属于 *P. mirabilis*。这些发现支持 *P. mirabilis* 是与中国东北地区腹泻梅花鹿仔鹿相关的重要细菌病原体，同时强调仔鹿腹泻的多因素性质，其病因学贡献应结合其他宿主、环境和管理因素解释。该研究为鹿源 *P. mirabilis* 的耐药监测、抗菌药物谨慎使用和后续机制研究提供了依据。

关键技术方法方面，样本队列来源为2022至2024年黑龙江、吉林、辽宁17个鹿场的233份腹泻梅花鹿（*Cervus nippon*）仔鹿粪样，纳入75株非重复 *P. mirabilis*。方法包括：菌落形态、革兰染色、16S rRNA 基因测序、包含模式株的系统发育分析及 atpD 基因靶向 PCR 补充鉴定；PCR 检测毒力基因和 AMR 基因；肉汤微量稀释法测定18种抗菌药物最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）；结晶紫染色评估生物被膜；SPF（specific pathogen-free）BALB/c 小鼠口服灌胃和腹腔攻击，观察临床表现并检查心、肝、脾、肺、肾组织病理；对主要攻击株 Y24N1546 进行 Nanopore 长读长和 Illumina 短读长 WGS，混合组装后用 FastANI、GGDC 和 TYGS 进行基因组分类。

研究结果部分，3.1 *P. mirabilis* 的分离与分子鉴定：通过菌落形态、革兰染色、16S rRNA 基因 PCR/测序和 atpD 靶向 PCR，从腹泻仔鹿粪样中获得75株非重复 *P. mirabilis*。分离株为革兰阴性短杆菌，在 TSA 上呈 swarming，在沙门菌-志贺菌（*Salmonella-Shigella*, SS）选择性琼脂上受抑制。16S rRNA 基因扩增约1,480 bp，Sanger 测序和 BLAST 显示与 *P. mirabilis* 参考序列高度相似；atpD 靶向 PCR 获得约595 bp 单一条带。结论是75株均鉴定为 *P. mirabilis*。

3.2 系统发育分析：基于1,341 bp 16S rRNA 基因序列构建包含模式株的邻接（Neighbor-Joining, NJ）系统发育树，采用1,000次 bootstrap。75株均位于含 *P. mirabilis* 模式株 ATCC 29906^T、实验室参考株 ATCC 12453 及额外参考序列的谱系内，并与近缘 *Proteus* 模式株分开。结论是系统发育支持所有75株为 *P. mirabilis*。

3.3 主要攻击株 Y24N1546 的全基因组确认：对 Y24N1546 进行 WGS，获得1.75 Gb 干净 Oxford Nanopore 数据，206,770 reads，read N50 为15,528 bp；混合组装得到单条环状染色体4,073,229 bp，G+C 含量39.11%。与 ATCC 29906^T 比较，FastANI 的 ANI 为98.94%，1,357个查询片段中1,216个映射（89.61%）；GGDC 推荐 Formula 2 dDDH 值为93.4%（95%模型置信区间91.5–94.8%），G+C difference 为0.50%。TYGS 独立将 Y24N1546 归入 *P. mirabilis*，与模式株处于相同种和亚种聚类，全基因组 GBDP（Genome BLAST Distance Phylogeny）系统发育平均分支支持97.4%。结论是强支持 Y24N1546 为 *P. mirabilis*。

3.4 毒力基因谱：采用 PCR 检测毒力基因。毒力基因组合多样，最常见组合为 atfA、atfC、ureC、zapA、rsbA（23株，30.67%）；atfA、atfC、ureC、zapA、rsbA、ucaA（12株，16.00%）；atfA、pmfA、atfC、ureC、zapA（9株，12.00%）；atfA、pmfA、ureC、zapA（8株，10.67%）；6株（8.00%）未检出目标毒力基因。结论是分离株携带多种毒力基因且组合多样。

3.5 AMR 基因谱：PCR 检出 tetA、tetB、tetO、rmtA、ant(3″)-I、strA、sul2、sul3、blaTEM、blaCTX-M、blaOXA-1、blaKPC、mcr-9 等基因的多种组合，涉及β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、磺胺类和多黏菌素类相关耐药。结论是分离株携带多种 AMR 基因。

3.6 抗菌药物敏感性：肉汤微量稀释法检测18种抗菌药物 MIC，结果呈广泛 MDR。亚胺培南敏感51株（68.00%），美罗培南敏感4株（5.33%），诺氟沙星敏感6株（8.00%），加替沙星敏感3株（4.00%）。头孢曲松、氨苄西林、哌拉西林、多黏菌素B、庆大霉素、妥布霉素、卡那霉素、四环素、磺胺异噁唑、甲氧苄啶、氯霉素和氟苯尼考均100.00%耐药；多西环素耐药70株（93.33%）、中介5株（6.67%）；磷霉素钠耐药55株（73.33%）、中介20株（26.67%）。结论是菌株耐药谱严重。

3.7 生物被膜形成能力：结晶紫染色评估生物被膜。所有75株均能形成生物被膜，ODc（cut-off optical density）为0.085；3株（4.00%）为中等生物被膜产生者，72株（96.00%）为强生物被膜产生者。结论是绝大多数分离株具有强生物被膜形成能力。

3.8 小鼠致病性：小鼠口服灌胃 Y24N1546 或混合分离株悬液后2天内出现明显腹泻，空白对照组无类似症状。腹腔攻击不同毒力基因谱代表株后出现嗜睡、厌食、被毛竖立、活动减少和腹泻；Y24N1546 在1×10⁹ CFU（colony-forming unit）和2×10⁸ CFU剂量下均6/6死亡，死亡时间16 h。其他代表株不同剂量下死亡数不同。Y24N1546 攻击后死亡或安乐死小鼠的心、肝、脾、肺、肾组织病理学检查显示病变。结论是代表株具有肠道和系统性致病潜力。

讨论部分总结：*P. mirabilis* 是临床重要机会致病菌，可引起人及动物泌尿、消化道、呼吸、伤口和全身感染，也是导管相关尿路感染和食源性疾病相关病原。兽医中已从家禽、犬、牛和毛皮动物等分离。研究人员从腹泻仔鹿粪样反复回收 *P. mirabilis*，系统表征显示75株均归入 *P. mirabilis*；全基因组 ANI、dDDH 和 TYGS 对主要攻击株 Y24N1546 提供高分辨率确认。毒力基因编码黏附、运动、脲酶、免疫逃逸和定植相关决定因子；毒力基因负担较高的代表株在腹腔攻击中死亡更多、存活更短，口服灌胃诱导腹泻支持肠道致病潜力。但未进行基因敲除和互补，检测到的基因组合应解释为与致病性增强相关，而非直接证明其单独赋予增强毒力。耐药方面，分离株呈 MDR；PCR 检出β-内酰胺、氨基糖苷、四环素、磺胺和多黏菌素相关基因，但表型耐药并非总由检出基因解释，可能与未检测的耐药决定因子、染色体突变、膜通透性改变、外排泵、生物被膜或基因表达差异有关。PCR 耐药基因谱应视为耐药组（resistome）的部分表征，未来需 WGS 和表达分析。药敏显示亚胺培南敏感率68.00%、美罗培南5.33%、诺氟沙星8.00%、加替沙星4.00%，比其他动物源和人源 *P. mirabilis* 报道更严重；碳青霉烯类对产超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase, ESBL）肠杆菌严重感染重要，敏感性降低尤其令人关注。多黏菌素表型耐药而未检出 mcr 基因，可能与脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）修饰相关染色体机制如 arnBCADTEF operon 和 eptB 有关。研究强调谨慎使用抗菌药物和持续耐药监测。生物被膜增强环境持久性和抗生素耐受，并促进水平基因转移；96.00%为强生物被膜产生者，与多重耐药分离株常形成更强生物被膜一致。局限性包括仅纳入腹泻仔鹿、无匹配健康对照系统分析；仅主要攻击株进行 WGS；耐药基因采用靶向 PCR 而非全基因组耐药组和表达分析；小鼠腹腔攻击模型不能完全重现自然肠道感染。

结论翻译：总之，本研究表征了从中国东北腹泻梅花鹿仔鹿中回收的75株多重耐药 *P. mirabilis*。基于基因组的 ANI、dDDH 和 TYGS 分析为主要攻击株 Y24N1546 提供了强物种水平确认。分离株携带多种毒力基因和 AMR 基因，表现出 MDR 表型，并显示中等至强生物被膜形成能力。代表性分离株经口服灌胃诱导腹泻，并在小鼠腹腔攻击后引起全身性疾病、死亡和组织病理学病变。这些发现支持 *P. mirabilis* 是与中国东北地区腹泻梅花鹿仔鹿相关的重要细菌病原体，同时其贡献应在仔鹿腹泻多因素性质背景下解释。