雪茄烟叶填充叶与茄衣发酵过程中微生物演替与生化变化的比较分析

《Frontiers in Microbiology》：Comparative analysis of microbial succession and biochemical changes in cigar tobacco filler and wrapper leaves during fermentation

　　

专业术语翻译的论文摘要 对雪茄烟叶进行散装发酵，将微生物演替与化学转化耦合在一起；然而，在相同的工业条件下，商业上不同的填充叶和茄衣是否遵循不同的生态和生化轨迹仍不清楚。利用16S rRNA和ITS扩增子测序，结合常规化学指标和挥发性物质谱分析，研究人员追踪了填充叶和茄衣（两个商业品种，品种204和品种108）在工业散装发酵的第0、10、18、49和89天的变化。结果显示，填充叶中的还原糖下降了63%（从0.57%降至0.21%），茄衣中的还原糖下降了66%（从0.59%降至0.20%）；而生物碱的动态在不同材料间存在差异：填充叶在发酵中期出现短暂上升后下降，而茄衣则从一开始就下降。细菌群落从早期以变形菌门（Proteobacteria）为主的组合，向后期发酵中厚壁菌门（Firmicutes）增加的方向转变，其中主要属包括不动杆菌属（Acinetobacter）、葡萄球菌属（Staphylococcus）和假单胞菌属（Pseudomonas）。真菌群落主要以子囊菌门（Ascomycota）为主，曲霉属（Aspergillus）在整个发酵过程中普遍存在，而Papiliotrema属则在后期阶段变得更加普遍。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析显示，细菌和真菌群落均呈现出结构化的定向演替，并且发酵时间解释了比材料类型更多的群落变异（细菌：R2 = 0.57 vs. 0.04；真菌：R2 = 0.42 vs. 0.08）。相关性分析、冗余分析（RDA）和网络分析将细菌和真菌群落的变异与糖类、含氮化合物、生物碱和挥发性物质类别联系起来，尽管这些关联是相关性的而非因果性的。通过在相同的工业发酵环境下直接比较填充叶和茄衣，本研究强调了商业上不同的雪茄原料遵循不同的生态和生化轨迹，为发酵监测和特定原料的品质管理提供了基于过程的依据。

论文解读文章

研究背景与科学问题

许多植物源性原材料，如茶叶和烟草，需要经过采后生物加工，包括发酵或陈化，以改善感官品质、减少不良成分并提高可用性。在烟草加工中，发酵是改善烟叶品质、香气和燃烧性的不可或缺的步骤。未发酵的烟叶通常表现出刺激性、不良气味和香气不足，不适合用于雪茄生产。在发酵过程中，由内源酶和叶面微生物介导的一系列生化转化促进了生物碱、含氮化合物和多酚的降解或转化，同时促进了酯类、醇类、醛类和酸类等挥发性香气化合物的形成。堆式（散装）发酵依靠湿润叶片堆积后的自热效应，温度可能因增强的生物和物理化学活性达到55-65°C。微生物群落的组装和演替在烟草发酵中起着关键作用。先前关于烟草发酵的研究主要描述了单个材料的微生物群落组成、一般化学变化或发酵轨迹。然而，对于商业上不同的雪茄原料，如填充叶和茄衣，在相同加工环境下是否遵循不同的生态和生化轨迹，关注较少。这一区别很重要，因为填充叶和茄衣在结构和初始化学成分上不同，这可能影响底物可及性、微生物选择和香气发育的时间。因此，本研究旨在比较在同一地点、同一散装发酵制度下发酵的填充叶和茄衣雪茄烟叶，整合扩增子测序、常规化学指标和五个阶段的挥发性物质谱分析，以阐明其不同的发酵轨迹。

研究方法与技术路线

研究人员使用了来自中国海南儋州种植的雪茄烟叶，以品种204作为填充叶（F）采样，品种108作为茄衣（W）采样。约50公斤的每种材料分别在单独的堆垛中发酵。样品在发酵前（第0天）以及第10、18、49和89天采集，每次从堆芯约三分之二高度处取样。采用16S rRNA基因V5-V7高变区和ITS2区域的扩增子测序来分析细菌和真菌群落。同时，使用连续流动分析仪检测基本化学成分，并采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）分析挥发性化合物。所有统计分析均在R环境中进行。

研究结果

1. 1.
   发酵过程中基本化学成分的变化
   填充叶和茄衣的化学成分均表现出显著的时间变化。还原糖和总糖在两种叶片中均持续下降。填充叶的总氮含量在第18天达到峰值后下降，而茄衣在第10天急剧达到峰值后下降。钾含量总体上升，氯含量波动较小。填充叶的总生物碱含量在发酵早期上升，第18天达到最大值后下降；而茄衣的生物碱浓度则持续下降。
2. 2.
   发酵过程中挥发性化合物类别的变化
   两类叶片的主要挥发性化合物类别表现出不同的时间动态。总酸含量逐渐增加，尤其在茄衣中。总醇类波动显著，填充叶在第10天达到峰值，茄衣则在第18天。总醛类在填充叶中于第18天急剧增加。总酯类在发酵早期迅速积累，随后显著下降。总杂环化合物相对稳定。总酮类在早期出现明显峰值，尤其在填充叶中。
3. 3.
   发酵过程中的微生物多样性与群落组成
   细菌香农多样性指数在发酵过程中逐渐下降，尤其是第18天后，茄衣的下降更为剧烈。真菌多样性则在发酵中期（第18-49天）出现短暂上升。在门水平上，变形菌门（Proteobacteria）在整个发酵过程中占主导地位，但在后期厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度显著增加。子囊菌门（Ascomycota）是真菌中最主要的门。在属水平上，细菌中以不动杆菌属（Acinetobacter）、葡萄球菌属（Staphylococcus）和科萨克氏菌属（Kosakonia）为主，但其时间丰度差异显著。真菌中，曲霉属（Aspergillus）在所有时间点都是优势属。
4. 4.
   微生物群落的β多样性与时间演替
   基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）显示，细菌和真菌群落结构均存在清晰的与处理相关的时间变化。PERMANOVA分析证实，发酵时间解释了细菌和真菌群落变异的大部分（细菌R²=0.5735；真菌R²=0.4154），而材料类型的影响较小但真菌群落中显著（R²=0.078）。Bray-Curtis时间距离分析进一步确认了定向的微生物演替。
5. 5.
   微生物群落与化学成分之间的关系
   相关性热图和冗余分析（RDA）揭示了优势微生物类群与化学成分之间的显著关联。例如，厚壁菌门（Firmicutes）与总杂环化合物呈正相关，而与总酮类呈负相关。曲霉属（Aspergillus）与总氮、氯和总酯类呈负相关。RDA分析表明，细菌群落与总醛类、总酸类和杂环化合物共变，而真菌群落则与酯类、醛类和酮类相关联。
6. 6.
   微生物多样性与化学成分动态的网络关系
   基于相关性的网络分析揭示了微生物群落结构与化学动态之间的显著关联。细菌香农多样性与还原糖、总生物碱和总糖呈正相关，与钾和总杂环化合物呈弱至中度负相关。真菌多样性与总酮类呈中度正相关，与糖类呈负相关。

研究讨论与结论

本研究表明，雪茄烟叶发酵是一个时间结构化的过程，微生物演替与化学转化紧密耦合。在共同的发酵环境下，填充叶和茄衣在糖类、生物碱、挥发性和微生物组成方面表现出不同的时间轨迹，表明叶片类型影响发酵结果。研究人员强调，虽然相关性、冗余度和网络分析确定了群落变异与生化变化之间的稳健关联，但这些结果应被解释为生态学关系，而非因果关系的直接证据。研究的局限性包括：品种背景是混杂因素；样品采集仅代表堆芯区域；每个材料仅有一个发酵堆垛，生物学重复有限；研究周期仅为89天。最终，研究人员得出结论：通过阐明两种商业重要雪茄烟叶的比较发酵轨迹，本研究为过程监控、假设生成以及未来烟草和其他植物基发酵系统的优化提供了有用的基础。