乳酸菌无细胞上清液通过抑制生物被膜形成与宿主细胞入侵阻断泛耐药沙门氏菌定植——基于“同一健康”框架的体外机制研究

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Disrupting Salmonella colonization and resistance: probiotic cell-free supernatants inhibit biofilm formation and invasion in meat and human isolates

　　

背景：非伤寒沙门氏菌（non-typhoidal Salmonella enterica）因多重耐药（multi-drug resistant, MDR）及泛耐药（pan-drug resistant, PDR）菌株经食品供应链快速传播，仍是全球重大公共卫生威胁。本研究采用“同一健康”（One Health）横断面研究框架，调查从埃及临床胃肠炎病例及零售肉制品中分离的泛耐药沙门氏菌血清型（S. Enteritidis、S. Kentucky 和 S. Anatum）的发生率并进行生物防治。方法：研究人员对来自胃肠炎患者的临床样本（n=20）进行泛耐药沙门氏菌筛查，并通过invA基因聚合酶链式反应（PCR）进行确认；此外还纳入了此前从肉制品中分离的6株泛耐药菌株。生物防治效能评估采用由多种益生菌菌株联合培养制备的无细胞上清液（cell-free spent media, CFSM；即后生元制剂）。通过高效液相色谱法（HPLC）对CFSM进行化学成分分析。定量检测抗菌活性、最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentrations, MIC）及生物被膜形成能力。采用庆大霉素保护试验在人肠道上皮细胞系Caco-2中评估宿主细胞侵袭能力。利用透射电子显微镜（TEM）观察超微结构变化。通过逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）靶向生物被膜调控基因（csgD、sdiA）及沙门氏菌毒力岛1（Salmonella Pathogenicity Island 1, SPI-1）侵袭相关基因（hilA、invF、prgH、sipA）阐明转录组学机制。结果：来自瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）EMCC 1654 和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CCUG 30503 的CFSM表现出显著的抗菌和抗生物被膜活性。在亚抑制浓度（10% v/v）下，CFSM显著减弱了生物被膜形成，并将S. Kentucky对宿主细胞的侵袭效率降至未处理对照组的0.08%。TEM显微照片证实，经CFSM处理的细胞出现严重的细胞包膜崩解、膜脱离及胞质渗漏。RT-qPCR分析显示，主效生物被膜调控因子csgD（倍数变化：0.002）和群体感应受体sdiA（倍数变化：0.02）的表达显著下调。此外，关键的SPI-1侵袭基因也受到明显抑制，包括hilA（0.188）、invF（0.001）、prgH和sipA（0.037）。对首选候选菌株L. plantarum CCUG 30503 CFSM进行定量HPLC分析，鉴定出一种以乳酸（1.89 mg/mL）、琥珀酸（1.53 mg/mL）和乙酸（1.11 mg/mL）为主的多有机酸混合物。结论：源自乳杆菌属的后生元（CFSM）可作为有效的抗毒力制剂，既能破坏控制生物被膜合成的转录网络及SPI-1介导的宿主细胞入侵，又能物理性损伤细菌细胞壁完整性。这些发现凸显了益生菌CFSM作为一种可持续的非抗生素策略，在从食品到临床的连续体中减轻泛耐药沙门氏菌持续存在的潜力。

研究背景与科学问题

非伤寒沙门氏菌（non-typhoidal Salmonella enterica, NTS）是全球食源性胃肠炎及多重耐药感染的主要病原体。特定血清型如Salmonella enterica serovar Anatum等高危菌株，因其不断增加的耐药谱而带来严峻治疗挑战。沙门氏菌在食品供应链中的持久性主要源于其强大的生物被膜形成能力和协调的毒力机制，使其能够抵御零售肉类中的抗菌胁迫并成功侵入人肠上皮。然而，在许多发展中地区，零售肉类污染与人临床感染之间的流行病学联系仍不明确，对当地人畜共患传播动态的认识存在关键空白。为应对日益加剧的抗菌药物耐药性，近年来的研究越来越关注非抗生素生物防治策略，尤其是源自乳酸菌和产芽孢益生菌的后生元。尽管来自益生菌（如乳杆菌属、双歧杆菌属、肠球菌属和芽孢杆菌属）的无细胞上清液（CFSM）已被证明具有一般性抗菌活性，但这些代谢产物沉默特定毒力网络的精确转录机制尚不完全清楚。本研究基于前期对动物源食品中高危沙门氏菌血清型的流行病学特征描述，通过双重方法填补上述知识空白：首先，采用“同一健康”横断面设计，建立来自严重胃肠炎病例的泛耐药临床分离株与同一地理区域受污染零售肉制品之间的流行病学关联；其次，针对靶向抗毒力干预的治疗需求，研究多属益生菌CFSM制剂抑制关键表型和转录组毒力决定因素的能力，具体靶向调控生物被膜形成（csgD）、群体感应（sdiA）及沙门氏菌毒力岛-1（SPI-1）介导的侵袭（hilA、invF、prgH、sipA）的基因。

主要技术方法概述

研究人员采用了以下关键技术方法：1）从埃及Qalyubiyah省收集人类临床样本（10份粪便和10份血液标本）及前期流行病学调查中获得的零售肉制品样本（午餐肉、汉堡、香肠、碎肉、生肉、罐装牛肉和烤肉饼），分离并鉴定沙门氏菌；2）通过微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC），依据CLSI M100-ED33指南对9类抗生素进行表型药敏试验；3）通过靶向invA基因的属特异性PCR对分离株进行分子确认；4）制备11株分属4个属（乳杆菌属、双歧杆菌属、肠球菌属、芽孢杆菌属）的益生菌的CFSM，分别以MRS肉汤和脱脂复原乳为生长基质；5）通过琼脂孔扩散法和微量肉汤稀释法测定CFSM的抗菌活性和MIC及亚抑制浓度（SIC）；6）采用结晶紫染色法定量评估生物被膜抑制率；7）利用人肠上皮细胞系Caco-2进行庆大霉素保护试验评估细菌侵袭能力；8）通过逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析毒力基因表达变化；9）使用透射电子显微镜（TEM）观察超微结构改变；10）通过高效液相色谱法（HPLC）对最优候选菌株CFSM进行有机酸成分定量分析。

研究结果

选择与药敏试验表征泛耐药分离株： 研究人员从人类粪便/血液样本中前瞻性回收了3株临床S. Enteritidis分离株，并从前期监测框架中选取了6株肉制品相关分离株（3株S. Anatum和3株S. Kentucky）。通过微量肉汤稀释法进行的表型药敏试验证实，所有9株分离株均对所有9类测试抗生素类别（包括超广谱头孢菌素、碳青霉烯类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类）呈现完全耐药，确认为真正的泛耐药菌株。

泛耐药沙门氏菌分离株的分子鉴定： 所有9株泛耐药分离株均扩增出预期的284 bp invA基因片段，分子水平确认了其沙门氏菌属性。

益生菌CFSM的抗菌效力与机制剖析： CFSM的抑制活性显著依赖于生长基质。在MRS肉汤中培养的益生菌产生的抑菌圈显著大于在脱脂乳中培养的。其中，粗制瑞士乳杆菌EMCC 1654 CFSM表现出最强的杀菌活性（抑菌圈直径25-40 mm），其次是植物乳杆菌CCUG 30503。通过pH中和实验发现，粗制CFSM（pH 3.8-4.2）产生最大抑菌圈；pH中和后的CFSM（CFSM_neut，pH 6.5）在琼脂扩散试验中的抑菌作用完全消失或大幅减弱（0-8 mm），表明杀菌/生长抑制压力高度依赖质子化有机酸；酸性培养基对照（MRS_acid，pH 4.0）产生中等抑菌圈（12-18 mm），证实单独酸度可解释部分抗菌活性，但不及粗发酵物的完全效力。

益生菌CFSM以不依赖pH的方式减弱生物被膜形成： 在亚抑制浓度（10% v/v SIC）下，非酸性后生元能够主动破坏生物被膜结构。粗制CFSM表现出最强的生物被膜减少效果（各血清型减少78%-92%，p<0.0001）；pH中和后的CFSM保留了显著且高水平的生物被膜减弱能力（减少52%-71%，p<0.001）；而MRS_acid对照仅引起少量生物被膜质量减少（15%-24%）。这表明，虽然有机酸有助于总体生物量减少，但存在于中和后CFSM中的生物活性分子（如细菌素、生物表面活性剂）能主动干扰胞外聚合物基质和细胞附着机制。

益生菌CFSM减弱沙门氏菌对Caco-2细胞的侵袭效率： 庆大霉素保护试验显示，以10%（v/v）亚抑制浓度的粗制CFSM预处理，显著损害了泛耐药沙门氏菌血清型的侵袭能力。对于所有测试分离株，粗制CFSM处理导致人Caco-2肠上皮细胞内内化细菌数量较未处理对照出现多对数级减少。最显著的减弱出现在经植物乳杆菌CFSM处理的S. Kentucky中，胞内细菌负荷从6.20±0.15 Log₁₀ CFU/mL（对照）降至3.10±0.10 Log₁₀ CFU/mL（p<0.05），相当于基线侵袭力降低50%。经瑞士乳杆菌处理后，S. Kentucky的内化计数也显著降至4.45±0.12 Log₁₀ CFU/mL。临床分离株S. Enteritidis基线侵袭力最高（6.50±0.11 Log₁₀ CFU/mL），瑞士乳杆菌CFSM处理将其内化计数降至3.80±0.09 Log₁₀ CFU/mL。对于肉源分离株S. Anatum，植物乳杆菌CFSM预处理将胞内负荷降至4.20±0.14 Log₁₀ CFU/mL。值得注意的是，CFSM_neut预暴露在不改变病原体存活率的情况下，使内化细菌减少了1.8-2.4个对数级，而MRS_acid对照仅导致不到0.5个对数级的减少。

通过基因沉默实现沙门氏菌毒力的分子减弱： RT-qPCR分析显示，经瑞士乳杆菌和植物乳杆菌CFSM预处理后，S. Anatum、S. Enteritidis和S. Kentucky中所有6个靶向毒力基因均出现统计学显著的下调。在SPI-1侵袭机制方面，植物乳杆菌对S. Kentucky（0.071）和S. Anatum（0.188）的中心调控因子hilA施加了最强抑制；在S. Enteritidis中，植物乳杆菌几乎消除了prgH的表达（0.012），而invF在S. Kentucky（0.048）和S. Anatum（0.113）中被最严重地沉默；编码肌动蛋白结合蛋白的sipA在所有血清型中均显著下调，其中S. Enteritidis经瑞士乳杆菌处理后的减少最为显著（0.045）。在生物被膜和群体感应调控因子方面，植物乳杆菌展现出非凡的csgD沉默能力，在S. Kentucky中表达降至几乎检测不到的0.001，在S. Anatum中降至0.002；群体感应基因sdiA被持续抑制，瑞士乳杆菌对临床S. Enteritidis分离株尤为有效，将其表达降至0.020。热图分析表明，两种益生菌均为有效的抗毒力制剂，但其效力具有血清型依赖性：植物乳杆菌在沉默肉源分离株的生物被膜相关基因（csgD）方面显示出专长，而瑞士乳杆菌在抑制临床S. Enteritidis菌株的群体感应（sdiA）和侵袭效应子（sipA）方面表现更优。

粗制CFSM提取物诱导沙门氏菌的超微结构变化： TEM观察显示，经植物乳杆菌CFSM处理后，S. Kentucky出现明显的细胞包膜修饰，包括外膜波纹状变形、细胞轮廓扭曲、局部周质间隙扩张和胞质空泡化，表明早期膜受损。经瑞士乳杆菌CFSM处理后，观察到严重的超微结构损伤，包括显著的膜脱离和皱缩、突出的内部电子透明病变以及广泛的胞内物质丢失导致细胞裂解。

通过HPLC进行有机酸定量分析： 对植物乳杆菌CCUG 30503的CFSM进行HPLC分析，揭示了一种以乳酸（1.89 mg/mL）、琥珀酸（1.53 mg/mL）和乙酸（1.11 mg/mL）为主的多种有机酸组合，同时还有较小量的草酸（0.47 mg/mL）、乙醇酸（0.43 mg/mL）和苹果酸（0.30 mg/mL）。

讨论与结论

讨论部分总结： 本研究中从人临床胃肠炎病例和埃及零售肉制品中分离出的泛耐药沙门氏菌的高流行率，突显了该区域的重大公共卫生关切。通过invA基因PCR的分子确认及涵盖9类抗生素的药敏试验，验证了所有分离株的广泛耐药性，表明临床与食品供应链之间存在共同的耐药性状库。对植物乳杆菌CCUG 30503 CFSM的HPLC定量分析揭示了以乳酸、琥珀酸和乙酸为主的多酸化学组成，这构成了从活益生菌向后生元转变的基础优势。该后生元制剂的抗菌效力依赖于这种多酸混合物的协同作用而非单一组分的作用。TEM提供的直接形态学证据证实了CFSM在亚抑制浓度下对沙门氏菌细胞膜的破坏活性。除生长抑制外，研究发现生物被膜形成显著减少，其分子驱动因素是主效调控因子csgD的显著转录下调，同时sdiA的下调表明存在显著的群体感应淬灭效应。庆大霉素保护试验观察到S. Kentucky内化细菌减少3.1个对数级，侵袭效率降至0.08%，这与SPI-1调控子的同步分子抑制直接相关，该减弱机制沿SPI-1级联顺序运作：主效转录调控因子hilA下调、结构组装基因invF和prgH抑制、效应蛋白基因sipA下调。与近期主要强调一般性生长抑制的后生元文献相比，本研究表明益生菌后生元直接作用于调控沙门氏菌毒力的调控网络，通过下调T3SS结构组件和关键调控网络，提供了一种靶向生物防治策略，在减轻病原体毒力的同时避免了与传统抗菌药物相关的选择性压力。

研究结论翻译： 本研究证实，源自乳杆菌属物种的后生元无细胞上清液——以植物乳杆菌CCUG 30503为首选候选菌株——对从家禽和人临床环境中分离的泛耐药沙门氏菌血清型具有强效的抗菌、抗生物被膜和抗毒力活性。定量HPLC分析将此生物活性归因于以乳酸（1.89 mg/mL）、琥珀酸（1.53 mg/mL）和乙酸（1.11 mg/mL）为主的协同性多有机酸混合物。在亚抑制浓度（10% v/v）下，后生元组分诱导了控制生物被膜结构（csgD）、群体感应（sdiA）和SPI-1 T3SS侵袭（hilA、invF、sipA）的主效调控因子的转录组沉默。这种分子抑制与严重的超微结构膜损伤及Caco-2细胞侵袭效率的大幅降低（降至0.08%）直接相关。综上所述，这些发现确立了植物乳杆菌CCUG 30503后生元作为一种有效的非抗生素生物防治模式，可在食品安全和公共卫生连续体中对抗泛耐药沙门氏菌。