胶原靶向自锚定多功能抗菌肽COLTAMP的设计及其胶原结合与抗变形链球菌活性机制研究

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Collagen targeted self-anchoring antimicrobial molecular agents

　　

摘要：胶原的固有特性，结合其在组织中的天然丰度，以及伤口或损伤导致上皮任何裂隙后易于暴露，使其成为细菌定植的常见部位。在致密胶原纤维（如牙本质中的胶原纤维）内，结合的病原体部分免受抗生素渗透。随着抗生素耐药性日益普遍，微生物感染仍是持续存在的全球健康问题。在本研究中，研究人员设计了一种胶原靶向自锚定抗菌肽作为新型治疗剂，并在胶原平台上测试其多功能活性。研究人员的肽设计将一种抗菌肽（antimicrobial peptide, AMP）与另一种通过间隔结构域赋予胶原结合特性的肽相结合。对这种新型胶原靶向AMP（COLTAMP）肽进行了计算评估，以分析其同时表现出两种所需功能（胶原结合和抗菌活性）的潜力。利用傅里叶变换红外（Fourier-transform infrared, FTIR）和拉曼（Raman）光谱作为互补振动技术，确认了COLTAMP的预测二级结构。利用原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）表征了靶向AMP与胶原纤维的相互作用，为肽对纤维组织的影响提供了见解。使用抑菌圈试验，针对模型病原体Streptococcus mutans（变形链球菌）测试了靶向AMP的抗菌活性；该菌在口腔中旺盛生长，一旦进入血流便可定植于远处组织。在确认COLTAMP的抗菌活性后，研究人员接下来利用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）探索其作用机制。SEM成像确认，递送COLTAMP后细菌细胞壁发生破坏，对细菌膜完整性产生显著影响。所提出的自锚定靶向多功能肽可在胶原纤维上空间分布抗菌肽。选择性将生物活性结构域直接锚定至受损胶原的多功能靶向肽制剂，为涉及多种损伤部位的感染提供了潜在治疗策略。

研究背景与问题：胶原是细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的主要结构成分，具有良好生物相容性、可降解性并支持细胞黏附与生长，广泛用于骨、肌腱、口腔等组织修复。但胶原在组织中丰度高，伤口、植入、牙周袋或骨折等造成暴露后易被病原体定植；致密胶原纤维还可部分屏蔽抗生素渗透。抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）上升，传统抗生素疗效受限，促使开发可持续、有效且适应不同临床场景的替代策略。抗菌肽（antimicrobial peptide, AMP）不依赖细胞分裂和活跃代谢，在生物膜环境中仍有效，且耐药风险低；胶原结合肽（collagen-binding peptide, CBP）可特异结合胶原纤维、稳定结构并减少酶降解。因此，研究人员设计将AMP与CBP通过间隔区连接的多功能肽，即胶原靶向AMP（collagen targeted AMP, COLTAMP），以期在胶原支架上自锚定并抗菌。选择变形链球菌（Streptococcus mutans, S. mutans）为模型病原体，因其与龋病和牙本质界面复合树脂修复失败相关，也代表胶原丰富环境的微生物挑战。研究人员通过计算设计、合成、光谱验证、抗菌试验、显微形貌和胶原组装分析评价其双功能。结果显示COLTAMP保留α-螺旋为主结构，能抑制S. mutans并通过破坏细胞壁发挥作用，同时调节胶原纤维组装。这为开发具有肽可调特性的胶原-抗菌生物材料提供了依据，可用于组织修复、重建和再生中的感染控制。

主要关键技术方法：研究采用PEP-FOLD 3.5、ChimeraX 1.8和HeliQuest预测肽结构、螺旋轮投影及理化性质；用固相肽合成制备肽；用衰减全反射傅里叶变换红外（attenuated total reflectance Fourier-transform infrared, ATR-FTIR）和拉曼光谱验证二级结构；用抑菌圈、肉汤微量稀释结合刃天青（Resazurin）法测定抗菌活性和最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）；用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）观察细菌形貌；用原子力显微镜（atomic force microscopy, AFM）表征胶原纤维组装。样本来源：S. mutans UA159（ATCC^? 25175^?）；I型胶原为大鼠尾来源。

研究结果：
3.1 肽结构与性质：COLTAMP由CBP LRELHLNNN、GGG间隔区和AMP KWKRWWWWR-NH₂组成。计算显示CBP采用α-螺旋，AMP呈α-螺旋并具两亲性，间隔区提供分隔和柔性。疏水表面显示CBP更亲水、AMP更疏水；静电场正电主要集中于AMP。理化性质显示COLTAMP分子量2,792.17 g/mol，理论pI 12.43，pH 7净电荷+5，GRAVY ?1.562，提示良好亲水性和溶解性。

3.2 FTIR和Raman光谱分析：FTIR显示酰胺I带1,658 cm^?1，位于α-螺旋范围；酰胺II 1,533 cm^?1，酰胺A 3,286 cm^?1，提示氢键稳定的螺旋骨架。Raman显示四个色氨酸主导，763和1,016 cm^?1等峰；酰胺I 1,644 cm^?1支持α-螺旋，1,673 cm^?1提示少量β-转角/反平行β-折叠，酰胺III提示无序/随机卷曲。两种光谱与计算预测一致，COLTAMP以α-螺旋为主，含少量转角和柔性元件。

3.3 细菌生长抑制研究：抑菌圈试验中，AMP抑菌圈9.34±0.29 mm，COLTAMP 8.44±0.11 mm，CBP无抑菌圈，CHX（chlorhexidine，氯己定）14.67±0.45 mm。说明COLTAMP保留抗菌活性，CBP无杀菌作用。溶液刃天青试验中，COLTAMP从8 μg/mL开始抑制生长，64 μg/mL完全抑制（MIC），CBP无抗菌活性。

3.4 SEM观察S. mutans膜形态：未处理菌为完整杆状、表面光滑、紧密聚集。AMP处理后表面不规则、粗糙和结构塌陷；COLTAMP处理后严重变形，许多细胞肿胀或破裂，显示细胞壁破坏、膜完整性受损，且效果更明显。

3.5 AFM分析胶原纤维组装与粗糙度：单独胶原形成致密随机取向纤维，平均宽度20.70±1.14 nm，变异系数（coefficient of variation, CV）0.055，表面平滑。加入CBP后纤维更粗、聚集，平均宽度24.06±2.19 nm，粗糙度增加。加入AMP后纤维组织性下降，平均宽度23.20±3.66 nm，CV 0.158，表面更平滑（R_q=0.602 nm，R_a=0.474 nm）。COLTAMP组纤维最窄，平均宽度17.26±2.83 nm，CV 0.164，粗糙度最高（R_q=1.62 nm，R_a=1.24 nm），表明其双域设计同时引入局部聚集和干扰规则装配。

讨论与结论：讨论认为，FTIR和Raman一致证明COLTAMP在固态以α-螺旋为主，并含少量β-转角、反平行β-折叠和无序元件；结构异质性反映域结构。酰胺A和II提示广泛氢键稳定螺旋。抑菌圈显示COLTAMP保持接近AMP的活性，CBP无活性；较小抑菌圈与其双域靶向自锚定功能相符，局部滞留可能比扩散试验中抑菌圈大小更具治疗意义。SEM提示COLTAMP保留细胞壁破坏作用并可能引入额外失稳相互作用。AFM提示CBP促进纤维侧向成束，AMP干扰胶原纤维层级组装；COLTAMP同时具有两种效应，导致纤维更薄、更粗糙。研究人员认为COLTAMP有望作为抗菌胶原基材料，但仍需评估细胞安全性和生物相容性，以及液态构象和对多种细菌的定量抗菌指标。胶原基生物材料可用于药物递送、止血、皮肤软组织修复、肌腱修复、骨修复和牙周再生；COLTAMP在可能非无菌环境中最有价值，如口腔、开放性骨折、烧伤、跟腱修复、肿瘤切除颅骨切开、头颈癌下颌重建（±放疗损伤）、眶底骨折和放疗损伤后骨癌切除等。

研究结论翻译：胶原是人体中含量最丰富的蛋白质，分布于骨、口腔、皮肤、软骨、肌腱和角膜等组织。因此，胶原基支架在促进这些组织修复、重建和再生方面具有巨大潜力。然而，这些组织中的任何破裂、伤口、植入物插入、牙周袋或骨折都会使胶原暴露于病原体攻击。其致密结构还可为结合于胶原的病原体提供屏蔽，使抗生素和/或抗菌剂穿透有限。研究人员设计了一种多功能肽COLTAMP，将抗菌肽与胶原结合特性整合。研究人员评估了COLTAMP的抗菌和胶原自组装特性。FTIR和Raman光谱确认该多功能肽主要采用α-螺旋构象，并广泛氢键稳定，含少量β-转角和有序/无序元件，反映其多功能域结构固有异质性。研究人员研究了肽结构以确认其与胶原和细菌膜相互作用的潜力，并通过抑菌圈试验显示该肽对S. mutans有活性。SEM研究揭示其作用机制并显示COLTAMP导致细菌细胞壁破坏。与AMP相比，COLTAMP对细胞壁破坏表现出更明显影响，提示COLTAMP的胶原靶向活性可能有助于其在胶原纤维上的空间分布，从而增强抗菌活性。AFM分析显示，掺入COLTAMP通过引入纤维宽度和表面形貌异质性调节胶原自组装。其由柔性间隔区连接的双域结构可能引入竞争性相互作用，破坏胶原典型组装动力学，形成更薄、不规则且表面粗糙度高的纤维。COLTAMP的多功能性提供了一种基于肽的可调策略，用于在组织修复、重建和再生支架中提供微生物抑制和胶原结合。