交错采样SLIDE显微术：面向荧光寿命的自适应像素速率高速多光子成像

《Frontiers in Photonics》：Interleaving SLIDE microscopy

　　

双光子显微术（Two-Photon microscopy，TPM）是一种活体成像技术，具有深组织穿透、高三维分辨率和低光漂白。然而，传统上成像速度受限于图像由点扫描生成。近期，衍射激发光谱-时间激光成像（Spectro-Temporal Laser Imaging by Diffractive Excitation，SLIDE）引入了一种用于双光子显微术的高速激光扫描方法，其利用扫频源激光器与衍射光栅相结合，实现无惯性点扫描，线速率达兆赫兹（Megahertz，MHz）频率，帧速率在千赫兹范围。值得注意的是，像素速率达到高达吉像素/秒（Gigapixels/s），其与超短二次谐波产生（second harmonic generation，SHG）信号相匹配。然而，该纳秒级像素驻留时间对荧光衰减而言过短。在此，研究人员提出一种高速多光子成像的自适应方法，其中SLIDE显微镜的像素速率可适应样品的荧光寿命。这通过交错采样实现，允许在时域中采用更大的时间间隔，同时保持空间采样密度。研究人员通过电光调制器（electro-optic modulator，EOM）上的灵活主动脉冲调制展示了自适应帧速率SLIDE显微术，并讨论了如何将其扩展至未来智能SLIDE系统，其中像素驻留时间可针对每个样品进行最优设置。

研究背景与问题：双光子显微术（Two-Photon microscopy，TPM）由于具有内在光学切片、降低光漂白和在散射组织中增强成像深度等特性，已成为深组织光学成像的重要工具。然而，传统TPM的可实现帧率受束扫描系统机械惯性限制。因此，尽管TPM常用于神经科学中基于钙离子的神经元活动成像，但基于电压的神经元活动快速动态需要千赫兹范围帧率。衍射激发光谱-时间激光成像（Spectro-Temporal Laser Imaging by Diffractive Excitation，SLIDE）通过沿快轴引入非机械、超快扫描机制实现超快TPM。SLIDE利用傅里叶域锁模（Fourier domain mode-locked，FDML）激光器提供兆赫兹（MHz）范围快速可调、窄线宽扫频源；输出经电光调制器（electro-optic modulator，EOM）调制成皮秒脉冲，并在主振荡功率放大器（Master Oscillator Power Amplifier，MOPA）中放大，峰值功率可达千瓦范围。将激光源导向衍射光栅后，FDML-MOPA的快速扫频产生无惯性x轴扫描，具有高达GPixel/s的脉冲到像素映射；每次扫频产生一条线扫描，达到MHz线扫描速率，结合慢轴振镜可达到kHz帧率点扫描成像。但高扫描速率引入限制：像素驻留时间（约1 ns）短于典型染料荧光寿命，由于脉冲到像素映射，这种不匹配导致光子泄漏至相邻像素，并限制获得SLIDE固有的荧光寿命成像显微术（fluorescence lifetime imaging microscopy，FLIM）数据的能力。若将脉冲率降低至常规TPM水平（≤80 MHz），可防止或减少泄漏。此前研究报道了使空间采样模式适应样品的方法，甚至调整时间采样以适应较长荧光寿命衰减；SLIDE已被证明支持用于自适应采集的灵活采样模式。本研究中，研究人员在时间域采用自适应采样，以适应荧光发射产生的更长衰减时间，或通过利用超快二次谐波产生（second harmonic generation，SHG）信号提高采集速度。为此，SLIDE完全可编程光谱扫描可实现交错方案，其中后续扫频用于采样整条线，同时留出足够时间容纳荧光衰减。电光脉冲发生器由模拟输入信号驱动，实现按需脉冲操作，脉冲图案可即时改变；通过在任意波形发生器（arbitrary waveform generator，AWG）上编程交错图案，可编程有效像素驻留时间。在本文实现中，线扫描率保持恒定（1.6 MHz），而图像线由多次线扫描通过交错采样构建。这种自适应像素速率SLIDE显微镜允许高速FLIM，其中采集速度与样品匹配。

研究人员开展的研究、结论与意义：研究人员提出并实现一种自适应像素速率SLIDE显微镜，通过时间交错采样使像素速率适应样品荧光寿命，并用灵活主动脉冲调制展示自适应帧率SLIDE显微术。研究证明交错采样可保持空间分辨率，同时通过延长像素驻留时间避免像素串扰并解析荧光衰减；在快速非线性信号中，也可提高像素率至1.6 GHz。该工作为未来智能SLIDE系统奠定基础，其中像素驻留时间可针对每个样品最优设置，并在成像速度、信号质量和时间分辨率之间实现可编程权衡。

关键技术方法（≤250字）：系统使用商用FDML激光器（Optores NG-FDML-1060，定制10–30 nm扫频范围）作为FDML-MOPA种子，结合自制两级掺镱光纤放大器（ytterbium-doped fiber amplifier，YDFA），形成35 ps脉冲宽度、千瓦级峰值功率的脉冲扫频源。交错脉冲图案由可重编程AWG卡（Spectrum Instrumentation M4i.6633）生成并触发脉冲调制电子器件，另加HF开关在锁相环（phase-locked loop，PLL）常规操作与AWG图案间切换。x扫描由衍射光栅光谱-时间扫描完成，y扫描由振镜完成，z扫描由压电物镜扫描器完成。检测使用高速混合光电探测器（hybrid photo detector，HPD，Hamamatsu R11322U-40，上升时间400 ps）；荧光使用400 MHz跨阻放大器（transimpedance amplifier，TIA，FEMTO HCA-400M-5K-C），SHG使用2.5 GHz TIA（Sigtrona DCWBA3500M）；信号由4 GS/s模数转换器（analog-to-digital converter，ADC，AlazarTech ATS9373）采集。样本包括荧光珠（Thermo Fisher F8825、F8812）、尿素晶体、石蜡包埋组织切片和Euglena gracilis微藻；组织学检查经University of Lübeck伦理委员会批准（No. 2024589）。

研究结果：
交错荧光成像：对2 μm荧光珠进行x2和x8交错成像。相同平均激光功率约130 mW下，x8交错因更高脉冲峰值功率产生约5倍更高信号；x2交错的时间迹显示荧光信号重叠并导致高像素串扰，而x8交错使像素驻留时间约10 ns，可解析荧光衰减。空间分辨率相当，说明使用多次扫频构建一条线不破坏图像映射。

扫描重复性统计分析：对500 nm荧光珠进行非交错和x8交错长时间采集，各平均1000次。非交错采样出现荧光信号泄漏至相邻像素，使珠在x方向拉长；二维高斯拟合检测中心的标准差σ=990 nm。x8交错成像未检测到荧光泄漏，检测标准差σ=186 nm，表明交错SLIDE提高检测精度。

可调脉冲率SHG成像（低至0.6 ns像素驻留时间）：对尿素晶体进行非交错和交错SHG成像，脉冲率从1.6 GHz降至205 MHz。SHG几乎瞬时响应，允许高达1.64 GHz像素率，即0.6 ns像素驻留时间而无像素串扰；降低脉冲率时每次激光脉冲峰值功率增加，产生更强谐波信号。测得的仪器响应函数（instrument response function，IRF）时间半高全宽约550 ps。同一显微镜可通过调整脉冲重复率适配不同信号类型。

交错荧光成像（组织切片）：对用SYTO82标记细胞核、Rhodamin 6G非特异染色的组织切片进行荧光寿命成像。不同荧光寿命通过HSV显示可视化，细胞核与组织寿命差异在平均（40 Hz）和非平均（400 Hz）成像中均可区分。非平均图像帧率400 Hz、脉冲率100 MHz；10次平均图像记录时间25 ms。对同一像素进行单指数衰减拟合，可区分Rhodamin 6G与SYTO82的衰减时间。

Euglena gracilis体积采集：以x4交错SLIDE进行二维扫描，帧率781 Hz，压电物镜扫描器以12 Hz正弦信号振荡，产生24 Hz体积扫描率，每体积32帧。体素尺寸为512×412×32（x,y,z），体素大小0.41×0.368×2 μm³，视场（field-of-view，FOV）为210×150×64 μm³。像素驻留时间约5 ns，足以抑制荧光泄漏。

交错SLIDE荧光寿命成像中的特征时间尺度与交错伪影：每个35 ps激发脉冲触发荧光衰减并由HPD记录。当脉冲间隔Δt=9.8 ns时，发射几乎返回基线，连续像素基本独立采样；当Δt=4.8 ns时，下一次激发脉冲落入前一脉冲仍在衰减的发射中，残余荧光延伸至下一像素检测窗，产生像素串扰；多周期累积后，残余贡献形成上升基线（泄漏），偏置每像素强度和寿命。

讨论部分总结与结论翻译：SLIDE提供纳秒像素驻留时间多光子成像，但遇到若干物理限制，即每像素光子数低和像素驻留时间短于荧光衰减时间。本工作提出交错方法，使SLIDE成像参数适应样品时间行为。对微米级荧光珠成像表明，时间交错保持空间分辨率；八倍更长脉冲间时间避免像素串扰，使像素驻留时间延长至约10 ns，从而解析荧光衰减曲线。伴随的更高峰值功率有效利用二次激发依赖，使荧光信号水平显著增加；使用交错脉冲图案后平均信号水平增加五倍。在所有交错因子下，未观察到抖动或跨扫频相位失配。对500 nm珠的检测精度统计分析证明交错SLIDE的主要益处：通过使像素驻留时间直接匹配荧光珠衰减特性，防止荧光泄漏，提高双光子图像精度；非交错SLIDE中荧光衰减超过像素驻留时间，检测珠结构在x方向拉长，而x8交错提高像素驻留时间抑制该效应并得到圆形珠图像。x扫描空间相位稳定性直接来自FDML扫频相位稳定性。交错SLIDE更高信噪比（signal-to-noise ratio，SNR）降低荧光信号统计噪声，提高高斯拟合精度，使逐帧二维高斯拟合标准差从非交错成像的990 nm降至x8交错成像的186 nm。另一方面，灵活脉冲调制允许在成像准瞬时谐波信号时提高像素率；研究人员展示尿素晶体SHG信号高达1.6 GHz像素率成像，快速检测带宽允许解析亚纳秒像素驻留时间而无像素串扰。交错也可用于提升信号水平，尤其谐波成像不受信号饱和影响。这表明同一显微镜可通过调整脉冲重复率适应不同信号类型。交错成像应用于生物标本成像时，通过拟合单指数衰减曲线，以高达400 Hz帧率展示基于荧光衰减的对比；仅使用单个检测器，荧光对比可通过颜色编码0.8至2.5 ns之间的荧光寿命清楚区分SYTO82染色细胞核与Rhodamin 6G染色周围组织。十倍帧平均提高SNR以获得高保真拟合结果，而40 Hz记录速率仍提供每平均图像25 ms的高时间分辨率。关于交错SLIDE下单脉冲FLIM的定量评估，包括寿命标准和详细拟合质量评估，是目前正在进行的工作，将另行报道。最后，交错SLIDE自然扩展至体积成像；交错因子直接控制体积率，因为体积率等于二维帧率除以轴向平面数（帧数），交错导致的F倍帧率降低线性传播至第三维。对Euglena gracilis以x4交错成像时，像素驻留时间约5 ns，足以抑制荧光泄漏，同时保持781 Hz帧率，分配到32个轴向平面后，在210×150×64 μm³视场中产生24 Hz体积率。因此，交错成为可编程权衡旋钮，平衡泄漏抑制与体积速度。实验期间未检测到光损伤；尤其Euglena gracilis微藻细胞在所施加激光功率下未显示任何效应，即使较长照明时间亦如此。对于x0.5交错（1.64 GHz）及所需更高激光功率（717 mW），该热负荷效应需在额外研究中分析。所提出的AWG驱动SLIDE系统的灵活性支持自适应方法：虽然研究人员展示的是逐图像调整交错脉冲图案，但系统技术能力允许实时、低延迟（5至10 ms）调整波形。由于一个波形包含完整图像扫描的控制信号，脉冲重复率可按像素定义。因此，原则上可以针对图像中各个感兴趣区域（regions of interest，ROI）以各自最优选择的交错设置进行寻址。未来，这种方法可与实时信号分析结合，使显微镜根据荧光寿命或信号强度自动选择合适脉冲时序和激发设置。这样，未来SLIDE系统可为每个样品单独优化成像速度、信号质量与时间分辨率之间的权衡。

结论翻译：生物标本通常表现出多种成像需求：样品中某些区域信号强度较低、荧光寿命较长或空间特征更锐利。为了优化成像参数，同时仍提供kHz帧率以捕获快速动态，智能显微镜应能够为每个感兴趣区域适配最佳成像参数。在本手稿中，研究人员提出了一种自适应SLIDE显微镜的技术实现，其表现出低延迟（5至10 ms）以实时更新成像参数。未来发展将聚焦于实时信号分析，从而使智能显微镜适应所研究样本。除成像速度外，这种智能显微镜还可主动平衡信噪比、帧率和所施加激光剂量之间的权衡，为每个区域选择在最低必要激发下提供足够信号的工作点。此类实时自适应智能显微镜将有助于利用kHz多光子成像阐明快速生物过程。