慢性XBP1s介导的未折叠蛋白反应激活损害CD8+ T细胞抗肿瘤免疫

《Frontiers in Immunology》：Chronic XBP1s-mediated activation of the unfolded protein response impairs CD8+ T cell anti-tumor immunity

　　

摘要专业翻译 CD8+ T细胞在抗肿瘤免疫中发挥关键作用；然而，其功能因慢性抗原暴露、不良肿瘤微环境和代谢功能障碍所驱动的耗竭而受损。活化的CD8+ T细胞经历广泛的蛋白质组重塑，其中包括未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）中IRE1-XBP1信号轴的诱导。然而，持续IRE1-XBP1激活在耗竭性CD8+ T细胞中的功能后果仍不明确。研究人员利用CD8+ T细胞中XBP1组成性激活的模型，证明持续的XBP1s信号导致稳态CD8+ T细胞群体减少、迁移能力受损以及抗肿瘤免疫力降低。值得注意的是，IRE1-XBP1轴的药理学抑制通过同时靶向肿瘤细胞和免疫区室的双重机制显著减少肿瘤负荷。研究结果揭示了XBP1s在调控CD8+ T细胞生物学中此前未被认识的作用，并强调IRE1-XBP1轴作为实体瘤治疗靶点的潜力。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

CD8⁺ T细胞是肿瘤控制和抗肿瘤免疫的核心效应细胞，然而其在肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中的功能常因慢性抗原暴露、代谢功能障碍和免疫抑制等因素而受损。CD8⁺ T细胞活化后经历广泛的蛋白质组重塑，总细胞蛋白含量增加3至4倍，这种高强度的生物合成需求要求细胞具备严格的蛋白质质量控制机制以维持蛋白稳态，其中包括未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）的激活。UPR由三条主要信号分支组成——肌醇需求酶1（inositol-requiring enzyme 1, IRE1）、蛋白激酶RNA样内质网激酶（protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase, PERK）和激活转录因子6（activating transcription factor 6, ATF6）。在稳态条件下，这些通路通过与内质网（endoplasmic reticulum, ER）分子伴侣BiP结合而维持失活状态；激活后，三条UPR分支启动各自独特且部分重叠的信号程序，协调细胞对蛋白毒性应激的适应。

在UPR信号分支中，IRE1通路调控两个主要过程：IRE1依赖性调控性mRNA衰减（regulated IRE1-dependent decay, RIDD）以及X盒结合蛋白1（X-box binding protein 1, XBP1u）mRNA的非常规剪接，产生活性转录因子XBP1s。鉴于肿瘤微环境中持续的抗原暴露和代谢应激特征，IRE1/XBP1信号极有可能调控CD8⁺ T细胞的功能状态（包括耗竭），对肿瘤免疫和免疫治疗疗效具有潜在影响。

然而，关于UPR在CD8⁺ T细胞中作用的研究仍然有限。既往研究表明，IRE1α或XBP1s的缺失不会损害CD8⁺ T细胞的发育或改变其频率；XBP1s在CD3和CD28交联联合IL-2存在下被诱导表达；肿瘤微环境中的胆固醇积累促进XBP1s上调，导致PD-1表达增加；在多发性骨髓瘤患者样本中，CD8⁺ T细胞中XBP1s水平升高与谷氨酰胺转运蛋白SNAT2下调导致的谷氨酰胺摄取减少相关。尽管如此，持续UPR激活在CD8⁺ T细胞中（尤其是肿瘤微环境内）的更广泛功能后果仍不明确。为直接探究持续XBP1s信号的影响，研究人员构建了一种在CD8⁺ T细胞中组成性过表达XBP1s的新型小鼠模型，系统研究了XBP1s对T细胞稳态、抗肿瘤免疫和迁移能力的影响。

二、主要技术方法

研究人员构建了CD8⁺ T细胞特异性XBP1s过表达小鼠模型（Rosa26-LSL-XBP1s^+/+CD8Cre⁺），利用E8_I-CD8Cre系统实现CD8⁺ T细胞特异性基因操作，并通过CRISPR/Cas9将eGFP标记的XBP1s构建体插入loxP-stop-loxP（LSL）盒下游以实现直接追踪。研究采用光谱流式细胞术进行免疫细胞表型分析和细胞分选，对分选的初始CD8⁺ T细胞进行批量RNA测序（bulk RNA-seq）以解析转录组变化，利用基因本体论（Gene Ontology, GO）分析富集通路。肿瘤研究采用MC38小鼠结肠癌细胞皮下接种模型，并使用IRE1 RNA酶抑制剂B-I09进行药理学干预。迁移能力评估采用Transwell迁移实验。此外，研究人员还利用TISCH2平台分析了人类结直肠癌单细胞RNA测序数据集（CRC_GSE108989）以验证XBP1在人类肿瘤浸润CD8⁺ T细胞中的表达模式。

三、研究结果

3.1 活化的人和小鼠CD8⁺ T细胞中XBP1s表达升高

研究人员首先分析了TISCH2平台公开可用的结直肠癌单细胞RNA测序数据集，发现XBP1表达主要富集于活化T细胞亚群中。将CD8⁺ T细胞分为中央记忆（T_cm）、效应（T_eff）和耗竭（T_ex）亚群后，观察到所有群体中XBP1表达均增加，其中效应T细胞中表达最高。体外CD3/CD28 DynaBeads刺激和体内MC38肿瘤分离的CD8⁺ T细胞中，XBP1s阳性细胞百分比均显著增加。这些数据表明XBP1s在人和小鼠肿瘤环境中活化的CD8⁺ T细胞中被诱导表达。

3.2 XBP1s应激信号损害外周CD8⁺ T细胞稳态并上调UPR

利用构建的CD8⁺ T细胞特异性XBP1s过表达模型，流式分析确认eGFP表达仅限于CD8⁺ T细胞区室，且XBP1s蛋白过表达得到验证。胸腺亚群分析显示XBP1s过表达不损害CD8⁺ T细胞发育。然而，外周淋巴组织分析显示脾脏中CD8⁺ T细胞频率和绝对数量显著减少。XBP1s-OE小鼠中效应/效应记忆（CD44⁺CD62L^-）和中央记忆（CD44⁺CD62L⁺）CD8⁺ T细胞减少，初始（CD44^-CD62L⁺）群体相对增加。RNA测序和主成分分析显示XBP1s-OE与对照CD8⁺ T细胞之间存在显著转录差异，UPR相关基因（Creb3l2、Nucb2、Dnajb9）上调，基因本体论分析显示UPR和蛋白转运相关通路富集。值得注意的是，趋化因子受体Cxcr3在XBP1s-OE CD8⁺ T细胞中显著下调。

3.3 组成性XBP1s上调降低肿瘤微环境中CD8⁺ T细胞的肿瘤参与和效应功能

将MC38结肠癌细胞皮下植入对照和XBP1s-OE小鼠后，XBP1s-OE小鼠肿瘤显著增大。肿瘤和引流淋巴结分析显示XBP1s-OE小鼠肿瘤微环境和引流淋巴结中CD8⁺ T细胞频率和绝对数量均显著减少。表型分析显示效应/效应记忆细胞显著减少，中央记忆和初始细胞相应增加。效应/效应记忆区室中PD-1和TIM-3共表达降低，提示肿瘤参与和慢性刺激减少。功能上，XBP1s-OE CD8⁺ T细胞在PMA和离子霉素刺激后IFN-γ和TNF-α产生显著减少，效应相关转录因子Tbet和效应细胞因子颗粒酶B水平降低。这些数据表明持续XBP1s表达削弱CD8⁺ T细胞活化、效应分化和细胞因子产生，从而损害抗肿瘤免疫应答。

3.4 慢性XBP1s激活限制CD8⁺ T细胞CXCR3表达和迁移能力

流式分析证实XBP1s-OE CD8⁺ T细胞在稳态条件下脾脏和腹股沟淋巴结中CXCR3蛋白表达显著降低，体外活化后效应和中央记忆CD8⁺ T细胞中CXCR3表达同样降低。利用OT-I-XBP1s-OE抗原特异性T细胞进行Transwell迁移实验，发现XBP1s-OE CD8⁺ T细胞在所有测试的CXCL10浓度下迁移能力均显著受损。这提示持续UPR激活通过下调CXCR3损害CD8⁺ T细胞向肿瘤微环境的募集。

3.5 IRE1-XBP1s的药理学抑制抑制肿瘤生长并恢复CD8⁺ T细胞功能

利用IRE1α剪接抑制剂B-I09（50 mg/kg，每周五次，持续两周）治疗荷瘤小鼠，B-I09治疗显著减缓肿瘤生长。肿瘤微环境和引流淋巴结中CD4⁺或CD8⁺ T细胞总体频率和绝对数量无显著差异，但耗竭标志物分析显示PD-1^中间群体增加，PD-1⁺/TIM3⁺细胞减少，表明从终末耗竭向功能更完备的肿瘤参与群体转变。肿瘤反应性CD8⁺ T细胞（PD-1⁺CD44⁺）中TIM3⁺LAG3⁺终末耗竭群体减少。高维流式细胞术结合UMAP降维和FlowSOM聚类分析发现，B-I09治疗组中一个富集早期肿瘤反应性激活标志物（CD44、PD-1、CD69、CXCR3）的细胞簇增加，且与TCF1表达相关的早期耗竭表型簇增多。CXCR3表达增加与前述XBP1s抑制CXCR3的发现一致，提示IRE1-XBP1s信号抑制可能恢复肿瘤微环境中的祖细胞样群体。

四、讨论与结论总结

本研究的关键创新在于开发了一种利用E8_I-CD8Cre-LSL系统在CD8⁺ T细胞中特异性上调XBP1s的新型小鼠模型，与既往以功能缺失研究为主的策略不同，该功能获得模型允许详细分析慢性XBP1s信号如何塑造CD8⁺ T细胞稳态和功能。研究发现组成性UPR激活导致稳态CD8⁺ T细胞数量减少，持续UPR激活的CD8⁺ T细胞抗肿瘤免疫力降低、肿瘤负荷增加，与激活和迁移能力缺陷相关。药理学抑制IRE1α介导的XBP1剪接减少了终末耗竭CD8⁺ T细胞群体，并扩增了功能更完备的肿瘤参与T细胞状态。

机制上，研究数据指向T-bet–CXCR3轴作为XBP1s驱动功能损害的关键下游介质。XBP1s过表达显著降低Cxcr3转录水平并在蛋白水平得到验证，同时伴随肿瘤浸润CD8⁺ T细胞中T-bet（Tbx21）表达降低。由于T-bet是CXCR3表达的关键转录激活因子，慢性XBP1s信号可能通过抑制T-bet–CXCR3迁移轴损害T细胞向肿瘤微环境的募集。研究人员倾向于间接模型，即XBP1s驱动的T-bet抑制继发性限制CXCR3和效应细胞因子表达，但尚不能排除XBP1s在Cxcr3或Tbx21位点的直接效应。

研究人员也承认研究的局限性：E8_I-CD8Cre系统驱动从胸腺发育期CD8上调开始的组成性XBP1s表达，可能引入稳态混杂因素；药理学抑制在免疫competent小鼠中不能区分内在和外在效应；B-I09的抗肿瘤效应不能正式确立主要通过CD8⁺ T细胞介导，因为IRE1α/XBP1信号在肿瘤细胞和其他免疫群体中同样活跃。未来需要诱导型或活化限制型Cre系统、CD8⁺ T细胞耗竭或遗传消融实验以及染色质结合分析和T-bet拯救实验来进一步明确机制。

研究结论： 本研究首次揭示了持续UPR激活作为CD8⁺ T细胞稳态和肿瘤相关功能中此前未被充分认识的内在调节因子，证明慢性XBP1s信号足以损害CD8⁺ T细胞的存活、激活和迁移能力，最终限制有效的抗肿瘤免疫。研究支持UPR抑制作为实体瘤治疗的一种有前景的治疗策略，并提示将B-I09与免疫检查点阻断联合使用可能具有协同效应。