新型重组嗜肺军团菌ST3043谱系在建筑水系统中的长期定植与复发性军团病暴发：225-kb同源重组重塑环二鸟苷酸（c-di-GMP）调控枢纽及生物膜结构

《Water Research》：Genomic and phenotypic characterization of a novel recombinant Legionella pneumophila lineage associated with long-term persistence in a building water system and recurrent legionellosis outbreaks

　　

新型重组嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）谱系的基因组和表型特征：与建筑水系统长期持续存在及复发性军团病暴发相关
• 谱系共存驱动建筑水微环境中的重组（recombination）。
• 225-kb重组事件重塑环二鸟苷酸（cyclic-di-GMP）调控枢纽，而未增加毒力基因（virulence genes）。
• 重组ST3043克隆在水网络中获得超过80%的优势度。
• 重组将生物膜（biofilm）结构重配置为广泛扩展的松散部分。
• 脱落的浮游细胞（planktonic cells）保持高活力和稳健的宿主感染性（host infectivity）。

研究人员报道了建筑水系统中一株新型重组嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）ST3043谱系的基因组和表型特征。嗜肺军团菌是军团病（Legionnaires' disease, LD）的病原体，可引发严重肺炎。工程化水系统为嗜肺军团菌提供了持续定植和增殖的生态位，细菌可在管道表面生物膜（biofilm）中生存，并通过淋浴、水龙头和冷却塔产生的气溶胶传播。尽管实施系统热消毒、冲击氯化（shock chlorination）和持续化学消毒等工程控制措施，长期定植仍是医疗、住宅和机构设施中的重大技术挑战。生物膜不仅提供物理保护，还形成动态微生物生态系统，其高细胞密度、紧密细胞间互作和胞外DNA积累促进水平基因转移（horizontal gene transfer）和同源重组（homologous recombination），加速基因组多样化和新遗传变异出现。西班牙国家军团病参考实验室（National Reference Laboratory for Legionellosis, NRL）20余年监测发现，一处大型机构设施在反复修复措施下仍出现复发性军团病病例和暴发，包括死亡病例。该长期污染为研究嗜肺军团菌在工程水系统中的适应进化提供了机会。研究人员采用长期流行病学监测、比较基因组学、贝叶斯系统动力学分析（Bayesian phylodynamic analysis）、基因表达谱、三维生物膜结构表征和宿主细胞感染性基准测试相结合的策略，旨在确定适应谱系的进化起源、相关基因组改变及其对生物膜表型、浮游细胞清除和在人巨噬细胞及上皮模型中胞内复制的影响。该论文发表于《Water Research》，作者为 Irving Cancino-Mu?oz、Juana María González-Rubio、Mireia Coscollá 和 Fernando González-Camacho。

方法概要：研究人员基于西班牙NRL长期监测，样本来自西班牙东北一所大型政府机构设施，该设施2001年7月启用，约1000名成年男性居民，含14个独立住宅模块。研究纳入2001—2024年环境与临床分离株，对29株嗜肺军团菌进行Illumina短读长全基因组测序，并选择4株代表株（2株ST3043、1株ST44、1株ST187；环境与临床来源）进行Oxford Nanopore长读长测序。另从NCBI获取截至2024年6月5742条BioSample记录，质控后构建5404株高质量组装数据库。方法包括比较基因组、Panaroo、Gubbins重组屏蔽、TempEst、BEAST2贝叶斯分子钟、静态生物膜与共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscope, CLSM）三维定量、荧光素二乙酸酯（fluorescein diacetate, FDA）水解代谢活力、U937巨噬细胞样与A549肺泡上皮细胞感染、RT-qPCR及统计比较。

结果部分：
3.1 新型L. pneumophila ST3043谱系在建筑水系统中的出现与长期建立：24年环境监测（2001—2024）显示，该建筑水系统经历反复工程干预和消毒。2004年1月首次记录军团病暴发，涉及3例；随后年均3.57例，2024年最多9例，2006年有死亡病例。尽管2006年进行3个月超氯化、安装约400个恒温阀/过滤器/止回阀等，并于2008年进行9个月生活热水系统改造，之后仍持续检出嗜肺军团菌。32株环境分离株中，25株为血清群1（serogroup 1, SG1）Pontiac Allentown/France，4株不可分型，2株SG6，1株Legionella taurinensis。序列分型（sequence-based typing, SBT）显示ST44、ST187、ST242和新ST3043长期共存，其中ST3043达21株；3株临床分离株也为ST3043。ST3043在环境分离株中占比超过80.7%，并在监测末期成为唯一与培养确诊临床病例相关的序列型；ST44和ST187仅限于环境。研究人员指出，监测存在选择性局限。

3.2 比较基因组学揭示ST3043的重组起源：完整基因组显示，ST44为3.38-Mb染色体和152-kb质粒，ST187为3.40-Mb染色体且无质粒，ST3043为3.34-Mb染色体且无质粒。环境与临床ST3043参考基因组高度保守，仅差6个单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms, SNPs），影响DNA复制和转录调控基因recQ、pilR及IV型分泌系统（type IV secretion system, T4SS）效应子位点ank1/legAS4。ST3043与ST187染色体核苷酸一致性为99.83%，与ST44为96.83%。全基因组比对发现ST3043中一个225,052-bp染色体区域与ST44几乎相同，一致性99.7%；该区域中ST3043与ST44仅差3个SNPs，而与ST187差3404个SNPs。结果表明，祖先ST187谱系通过同源重组从ST44样供体获得该大片段，形成ST3043。重组区包含SBT方案中的neuA和mip位点；ST3043保留5个来自ST187背景的SBT等位基因，而neuA和mip与ST44相同。24株ST3043的中位成对距离仅2.5个SNPs，支持近期共同起源后克隆扩增。贝叶斯分子钟估计替代率为1.22×10^?7/位点/年，ST3043最近共同祖先约在2001年（95%最高后验密度区间1996—2004），与建筑水系统启用时间重叠。

3.3 ST3043重组区中与环境持续和宿主细胞适合度相关的基因组特征：225,052-bp重组区含202个编码序列，功能包括调控蛋白、分泌相关系统、细胞表面结构、运输功能和代谢途径。其中含环二鸟苷酸（cyclic-di-GMP）信号相关基因，该网络与浮游和生物膜生活方式转换相关；还含T4SS相关蛋白、蛋白转运系统、转录调节子及环境适应和宿主互作相关酶。重组区编码脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）组装、表面多糖生物合成、肽聚糖生成和外膜组织相关基因。ST3043和ST44独有而ST187缺失的基因包括galE、wecA、neuB、wbbL、糖基转移酶、ABC转运蛋白、外膜相关蛋白和含四肽重复序列（tetratricopeptide repeat, TPR）蛋白。总体表明，该染色体片段的获得从ST187背景中引入了协调的调控、分泌、运输、细胞包膜和表面相关功能。

3.4 生物膜空间组织与分散浮游细胞活力：CLSM显示三种共存谱系生物膜三维结构明显不同，包括表面附着固着部分和上方非黏附松散部分。ST187形成薄、光滑、紧凑生物膜，平均厚度约24 μm；ST44形成异质固着结构约20 μm，含水通道和有限松散层；ST3043生物膜最厚，成熟固着结构约25 μm，具柱状和蘑菇状突起，上方广泛松散部分厚度约90 μm。体积重建显示，ST3043固着部分占总细胞体积88%，ST187为99.3%，ST44为98.4%；ST3043松散部分仅占总细胞体积12%，但占总体生物膜体积约95%，而ST187和ST44松散部分分别仅占0.7%和1.6%。FDA水解试验表明两个结构部分均含代谢活跃细菌；固着部分中ST44代谢活性显著低于ST187和ST3043，分散浮游部分中ST3043代谢活性最高，显著高于ST44和ST187。

3.5 宿主细胞依赖性胞内适合度：研究人员用分化的U937巨噬细胞样细胞和A549人肺泡上皮细胞比较三谱系胞内复制。在U937巨噬细胞中，感染后初始胞内负荷相似，约1×10³ CFU/mL；ST187有限存活，未能持续胞内复制；ST44和ST3043复制有效，20 h达约1×10⁶ CFU/mL，约25%巨噬细胞含胞内细菌簇；40 h时ST3043达约1×10⁷ CFU/mL，显著高于ST44和ST187（P<0.0001）；共聚焦显微镜确认ST3043胞内细菌负担和细菌/宿主细胞荧光强度比最高；72 h时ST44和ST3043因广泛宿主细胞裂解而趋同。在A549肺泡上皮细胞中，ST187和ST3043维持低胞内负荷，ST44逐渐增加并在72 h显著更高，形成局部感染灶但无明显细胞病变。总体而言，ST3043在巨噬细胞中胞内适合度最高，ST44在上皮细胞中复制能力最强，ST187在两种模型中均有限。

3.6 选基因拷贝数变异和转录谱：比较基因组发现谱系特异性拷贝数差异。ST3043和ST187各含两个cegC4、flhB和lpg2370拷贝，ST44各含一个；ankQ仅在ST44重复，ST3043和ST187为单拷贝；lem8在ST44缺失，ST187为两个拷贝，ST3043保留一个拷贝。RT-qPCR显示，lpg2370在ST3043中转录水平显著高于ST44和ST187（P<0.001）；鞭毛生物合成基因flhB在三谱系间差异显著（P<0.01）；ankQ、lapB、lem8和cegC4在测试条件下变化有限，但特定比较有统计学差异。结果表明，拷贝数变异影响多个适应和宿主互作相关基因，而仅部分基因在实验条件下表现可检测转录差异。

讨论部分总结：该研究显示，长期定植的工程水系统不仅是嗜肺军团菌储库，也是新细菌谱系出现和建立的环境。基因组和系统动力学分析表明，优势ST3043并非外源克隆引入，而是由同一管道网络中共存的ST44和ST187原位同源重组产生。最近共同祖先时间与建筑水系统启用时间接近，支持新基础设施为重组谱系出现提供生态背景，并在20余年监测中频率增加。工程水系统生物膜促进长期细菌互作、局部高细胞密度和胞外DNA积累，利于水平基因转移和同源重组；反复消毒、营养限制、水力剪切和微生物竞争形成选择压力。ST3043的成功并非获得大量新功能，而是用ST44来源的替代遗传构型替换既有区域。225-kb重组片段含200多个编码序列，是ST3043与ST187祖先的主要基因组差异，涉及调控、细胞包膜、分泌、运输和表面相关过程。重组区中环二鸟苷酸信号相关基因值得注意，该网络调控运动/固着转换、表面附着、生物膜成熟和分散。转录分析显示lpg2370和lapB等适应相关位点表达改变，但研究未建立重组区、基因表达和表型之间的直接因果关系。重组区还包含SBT所用neuA和mip位点，提示等位基因分型可能掩盖广泛基因组交换。ST3043最显著表型不是总生物量增加，而是生物膜结构改变：形成柱状和蘑菇状突起及广泛松散上层，该松散部分占大部分空间体积且代谢活跃，可能作为持续水力接种源。研究局限包括静态而非流动生物膜、历史水温和处理信息不全、单物种体外模型，以及未建立环境适应与致病潜力的直接因果。整合长期基因组监测与表型分析有助于理解细菌进化如何影响工程水系统持续存在，并可能早期识别新兴谱系。

结论部分翻译：工程水系统不仅是嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）的储库，也是长期持续、同源重组和环境压力可能促成适应局部水力条件的新谱系出现的生态环境。一次涉及225-kb染色体区域的大规模同源重组产生了新序列型ST3043，其结合了两个共存亲本谱系的遗传物质，并建立了在监测期同一建筑水系统中相对祖先种群逐渐增加频率的克隆。ST3043的长期优势与协调的表型性状相关，包括可能促进水系统中持续和细菌扩散的独特生物膜结构，以及在巨噬细胞感染模型中增强的宿主细胞适合度。这些发现提示，整合长期基因组监测与表型分析对于理解细菌进化如何影响工程水系统中的持续存在具有重要意义。此类方法可能改善在水管理策略受影响之前对新兴谱系的早期识别。