《Transboundary and Emerging Diseases》：ORF3 Depletion Attenuates SADS-CoV Virulence and Retains Partial Maternally Mediated Protection in Suckling Mice
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猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）是一种新发肠道冠状病毒，可导致新生仔猪严重腹泻和高死亡率。其广泛的宿主范围、对人源细胞的嗜性以及有限的疫苗可用性，突显了界定病毒致病性决定因素的重要性。附属蛋白ORF3已被联系到冠状病毒毒力，但其在SADS-CoV体
猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）是一种新发肠道冠状病毒，可导致新生仔猪严重腹泻和高死亡率。其广泛的宿主范围、对人源细胞的嗜性以及有限的疫苗可用性，突显了界定病毒致病性决定因素的重要性。附属蛋白ORF3已被联系到冠状病毒毒力，但其在SADS-CoV体内感染中的作用及其对母源传递保护的影响尚未完全确立。在此，研究人员利用反向遗传学技术，生成了rSADS-ΔORF3/GFP——一种以GFP替换ORF3的重组病毒，并将其与亲本rSADS-CoV在哺乳BALB/c小鼠中进行比较。相对于亲本rSADS-CoV，ORF3缺失显著减轻了疾病症状，并降低了各组织中的病毒RNA载量。鉴于母源获得性免疫对于保护新生动物抵抗猪肠道冠状病毒感染至关重要，研究人员进一步评估了rSADS-ΔORF3/GFP作为一种潜在的减毒活疫苗（LAV），能否激发从接种母鼠传递给后代的母源保护。与亲本rSADS-CoV相比，rSADS-ΔORF3/GFP诱导了较低的母源中和抗体滴度，并为受攻击的后代提供了较弱的保护。然而，与来自DMEM接种母鼠的后代相比，来自rSADS-ΔORF3/GFP接种母鼠的后代表现出更高的存活率、体重增加、较轻的肠道病理变化以及较低的组织病毒RNA载量，表明保留了保护性免疫原性。总之，这些发现支持ORF3对SADS-CoV毒力的贡献，并证明ORF3缺失产生了一种减毒病毒，该病毒保留了部分母源介导的保护效力。rSADS-ΔORF3/GFP残留的免疫原性，结合其降低的毒力，支持其作为LAV候选株的进一步评估。
研究背景与科学问题
猪急性腹泻综合征冠状病毒（Swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV）是一种新发的蝙蝠源性肠道甲型冠状病毒，于2016-2017年在中国广东省首次暴发，随后在江西、福建、广西等多个省份零星出现，并在越南猪场样本及韩国猪群血清学证据中被检出，表明其可能已扩散至最初发现区域之外。SADS-CoV感染新生仔猪可引起呕吐、脱水和严重腹泻，致死率高，对养猪业造成重大经济损失。更值得关注的是，SADS-CoV具有广泛的宿主范围和细胞嗜性，能在包括人源细胞系、原代人肺细胞和肠道细胞在内的多种物种细胞中复制，显示出跨种间屏障传播的潜在风险。然而，目前针对该病毒的疫苗非常有限。
SADS-CoV基因组编码三种附属蛋白，其中ORF3（又称NS3）被认为是潜在的致病性决定因子。已知冠状病毒的ORF3样蛋白是多功能调节因子，参与病毒复制、宿主膜重塑、免疫逃逸及疾病进程。例如，SARS-CoV-2的ORF3a具有离子通道活性，可通过干扰Rab7依赖的溶酶体运输、损害溶酶体功能来促进病毒释放，并激活NLRP3炎症小体加剧炎症反应；猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）的ORF3则通过干扰RIG-I样受体（RIG-I-like receptor, RLR）通路抑制I型干扰素信号。此外，在其他冠状病毒如传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV）和传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）中，删除ORF3相关区域或附属基因可导致体内毒力减弱。然而，SADS-CoV的ORF3是否同样调控病毒致病性和感染诱导的保护性免疫尚不完全清楚。同时，对于新生仔猪这类肠道冠状病毒疾病，临床结局不仅取决于病毒毒力，还高度依赖于母源被动免疫，尤其是经初乳和乳汁传递的乳源性免疫。因此，评估ORF3在SADS-CoV感染中的作用，需要同时考察病毒致病性和感染诱导的母源介导保护。尽管新生仔猪是最相关的自然宿主模型，但仔猪攻毒实验成本高、技术要求复杂，不适用于快速比较多个重组病毒。而前期研究表明，新生BALB/c小鼠（尤其2日龄）对SADS-CoV易感，表现出年龄依赖性死亡、有效病毒复制、组织播散和组织病理损伤，因此可作为早期体内评估SADS-CoV毒力的补充模型。
基于此，研究人员提出假说：SADS-CoV ORF3是一个毒力因子，其缺失可减弱疾病，但同时可能降低诱导母源保护所需的免疫原性，这一权衡关系对减毒活疫苗（Live attenuated vaccine, LAV）的开发具有直接影响。
主要研究方法与技术
研究人员采用反向遗传学技术，基于已建立的rSADS-CoV反向遗传系统，将ORF3区域替换为绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP），成功拯救出ORF3缺陷的重组病毒rSADS-ΔORF3/GFP。随后，研究人员使用了体外细胞培养（Vero细胞和猪睾丸ST细胞）、生长动力学测定、噬斑分析、实时定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）、Western blotting、免疫荧光共聚焦显微镜、组织病理学苏木精-伊红（H&E）染色、病毒中和试验以及小鼠体内感染和母源保护实验等多种方法。动物实验使用了购自广州瑞格生物技术有限公司的SPF级孕BALB/c小鼠，所有动物程序均经广东省实验动物监测所机构动物护理和使用委员会批准（协议号IACUC2021167）。
研究结果
3.1 ORF3缺失允许病毒拯救但降低在猪ST细胞中的复制
通过反向遗传学成功拯救出rSADS-ΔORF3/GFP，免疫荧光证实GFP阳性细胞同时表达SADS-CoV N蛋白。在Vero细胞中，rSADS-ΔORF3/GFP与亲本rSADS-CoV的生长动力学相似，表明ORF3并非Vero细胞中病毒复制的必需因子。但在ST细胞中，rSADS-ΔORF3/GFP的复制效率显著低于亲本病毒，48小时感染后的病毒滴度明显下降，且形成的噬斑更小。病毒吸附和进入效率无差异，提示复制缺陷发生在进入后阶段。由于Vero细胞缺乏I型干扰素产生能力，研究人员检测了干扰素和干扰素刺激基因（Interferon-stimulated genes, ISGs）的表达，发现rSADS-ΔORF3/GFP感染ST细胞后诱导了更强的IFN-β、ISG15、ISG54和IFITM1 mRNA表达，表明ORF3可能通过拮抗宿主抗病毒信号来促进病毒复制。
3.2 ORF3缺失减弱SADS-CoV在哺乳小鼠中的致病性
2日龄SPF哺乳小鼠口服接种1×106 TCID50的rSADS-CoV或rSADS-ΔORF3/GFP。在14天观察期内，rSADS-CoV感染组小鼠的存活率显著低于rSADS-ΔORF3/GFP组，且体重增长受到明显抑制。H&E染色显示，rSADS-CoV感染导致严重的肠黏膜损伤，包括绒毛破坏、上皮损伤和炎性细胞浸润，而rSADS-ΔORF3/GFP组的病变较轻。绒毛高度与隐窝深度比值（VH:CD ratio）的定量分析进一步证实，rSADS-CoV组的肠道损伤最严重，rSADS-ΔORF3/GFP组介于中间，表明ORF3缺失减弱了SADS-CoV的致病性。
3.3 ORF3缺失降低SADS-CoV在多组织中的病毒载量
在感染后3、6、10天收集心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、大肠和脑组织进行病毒RNA定量。两种病毒均可播散至全身组织，但rSADS-ΔORF3/GFP在所有检测器官中的病毒RNA载量均显著低于rSADS-CoV，尤其在胃、小肠、大肠和脑中降幅最大且最持久。对感染后1天的脑组织进行TCID50测定，也证实rSADS-ΔORF3/GFP组的感染性病毒滴度更低。这表明ORF3虽非系统性播散所必需，但有助于病毒在组织中的高效复制，从而解释了rSADS-ΔORF3/GFP致病性降低的病毒学基础。
3.4 ORF3缺失赋予针对SADS-CoV攻击的部分母源介导保护
雌性BALB/c小鼠分别接种rSADS-CoV、rSADS-ΔORF3/GFP或DMEM，共三次（间隔14天）。第二次接种后进行交配，第三次接种在分娩前完成。2日龄后代口服攻击1×106 TCID50的rSADS-CoV。来自DMEM接种母鼠的后代在攻毒后2天开始死亡，来自rSADS-ΔORF3/GFP接种母鼠的后代在3天开始死亡，来自rSADS-CoV接种母鼠的后代在4天开始死亡。在14天观察期内，来自rSADS-ΔORF3/GFP接种母鼠的后代存活率高于DMEM组但低于rSADS-CoV组，体重增长也呈中间状态。H&E染色和VH:CD比值分析显示，来自rSADS-ΔORF3/GFP接种母鼠的后代肠道损伤比DMEM组显著减轻，但仍比rSADS-CoV组严重。这表明rSADS-ΔORF3/GFP保留了可测量的免疫原性，能提供优于DMEM对照的部分母源保护，但弱于亲本病毒。
3.5 ORF3缺失降低母源对攻毒后SADS-CoV载量的限制
攻毒后3、6、10天检测后代各组织的病毒RNA。来自DMEM接种母鼠的后代在所有组织中均呈现高病毒RNA载量。来自rSADS-CoV接种母鼠的后代病毒载量显著降低，体现了高效的母源控制。来自rSADS-ΔORF3/GFP接种母鼠的后代病毒载量也低于DMEM组，但在大多数组织和时间点仍高于rSADS-CoV组，特别是在肠道、胃、脾脏和脑中持续可检测到较高水平。这证实ORF3缺陷病毒诱导的母源抗病毒保护较弱，只能部分控制攻毒后的病毒复制。
3.6 ORF3缺失降低免疫母鼠的中和抗体应答
在初次接种后14天和28天采集母鼠血清进行50%中和试验。两种病毒均诱导出可检测的中和抗体，且加强接种后滴度升高，但rSADS-ΔORF3/GFP组在两个时间点的中和抗体滴度均显著低于rSADS-CoV组。Western blotting、免疫荧光分析和细胞内病毒RNA定量均一致显示，来自rSADS-ΔORF3/GFP接种母鼠的血清抑制SADS-CoV感染的效果介于DMEM对照组和rSADS-CoV组之间。这表明ORF3缺失病毒诱导了较低但可检测的母源中和抗体，与其提供的部分保护相一致。
讨论与结论
本研究揭示了ORF3缺陷SADS-CoV报告病毒在哺乳小鼠中致病性降低、在接种母鼠中诱导较低中和抗体应答、以及在攻毒后代中提供部分母源介导保护的特性。ORF3缺失减弱了病毒复制和疾病严重程度，但这种减毒伴随着较低的母源中和抗体水平和较弱的后代保护，凸显了毒力与母源保护效力之间的权衡关系。尽管如此，ORF3缺陷病毒仍保留了可测量的免疫原性，并能提供相对于DMEM对照的明确保护，表明减毒并未完全消除其诱导母源传递免疫的能力。
在讨论部分，研究人员指出，冠状病毒附属蛋白通常在培养细胞中非必需，但可影响体内病毒适应性、宿主适应性和毒力。ORF3缺失在Vero细胞中不影响复制，但在ST细胞中复制降低，这与Vero细胞缺乏干扰素产生能力而ST细胞具有完整抗病毒信号的特征相符，提示SADS-CoV ORF3可能通过拮抗I型干扰素反应发挥作用，这与已知的ORF3相关蛋白的免疫调节活性一致。ORF3缺失的体内效应比体外更显著，导致更低死亡率、较轻生长抑制和肠道损伤，并与多组织病毒RNA载量降低相关联，支持ORF3在维持SADS-CoV体内复制或持续性中发挥作用的观点。关于母源保护，ORF3缺陷病毒诱导的保护弱于亲本病毒，可能归因于其减弱的复制限制了抗原负荷，进而降低了母源中和抗体应答的幅度。这突出了LAV开发中平衡减毒与足够免疫原性的挑战。研究人员承认了研究的局限性：哺乳小鼠模型不能完全再现自然宿主新生仔猪的感染情况；ORF3缺失病毒中GFP插入的影响无法与ORF3缺失完全分离；ORF3调控病毒适应性和免疫原性的具体机制有待阐明。
研究结论翻译如下：
总之，ORF3缺陷报告病毒rSADS-ΔORF3/GFP在哺乳小鼠中显示出降低的致病性，同时保留了可检测的母源中和抗体应答和对攻毒后代的部分保护。这些发现支持ORF3对SADS-CoV疾病严重程度的贡献，并突出了减毒与母源介导保护效力之间的关系。然而，ORF3缺失的影响无法与GFP插入完全分离，并且这些发现不应直接外推至新生仔猪。
